携带IL24和MnSOD双基因溶瘤痘苗病毒抗癌作用研究

发布时间：2017-07-20 21:10

  本文关键词：携带IL24和MnSOD双基因溶瘤痘苗病毒抗癌作用研究

  更多相关文章： 溶瘤痘病毒 双基因 抗癌研究 ZD55 溶瘤腺病毒 类肝癌干细胞

【摘要】：I癌症是目前严重威胁人类健康的最主要疾病之一,因此探索有效治疗癌症的方法显得十分重要。第一、二代溶瘤病毒对癌症的治疗都不理想。溶瘤痘苗病毒作为第三代溶瘤病毒有着更多的优势。它具有宿主范围广、复制速度快、副作用明确、允许插入长片段外源基因和引起抗肿瘤免疫反应等特点。删除溶瘤痘苗病毒的B18R或TK非必须基因,可以增强病毒对肿瘤细胞的靶向性且不影响其复制,故溶瘤痘苗病毒是一种理想的基因治疗载体。目前已经有报道称,在溶瘤痘苗病毒TK区插入一个外源基因有很好的抗癌效果。为了增强溶瘤痘苗病毒对癌细胞的杀伤效果,我们在痘苗病毒的TK区和B18R区分别插入IL24和MnSOD基因,构建了OncoPox-IL24-MnSOD重组病毒。IL24和MnSOD基因是最近几年发现的肿瘤抑制因子,在多种癌细胞中低表达,能抑制正常细胞向癌细胞转化、诱导抗肿瘤免疫反应、抑制癌细胞生长和诱导癌细胞凋亡等效果。本文通过同源重组的方法将外源基因IL24和MnSOD依次插到痘苗病毒的TK区和B18R区,单独在TK区插入MnSOD基因,成功构建了OncoPox-IL24-MnSOD,OncoPox-MnSOD两种病毒,使外源基因在癌细胞中表达,从而达到诱导癌细胞凋亡的目的。通过MTT实验和Hoechst染色实验,我们发现OncoPox-IL24、OncoPox-MnSOD和OncoPox-IL24-MnSOD三种病毒对不同的癌细胞具有不同的杀伤效果,但OncoPox-IL24-MnSOD杀伤效果要明显优于OncoPox-IL24和OncoPox-MnSOD单个病毒。故双基因溶瘤痘苗病毒对癌症的治疗可能会成为一种新的治疗策略。II癌症干细胞,也被称作肿瘤起始细胞,具有高转移、高耐药性和高致瘤性的特征,而且对肿瘤的发生、维持和复发起着关键性的作用。据报道,溶瘤腺病毒能够靶向和杀死癌症干细胞,被认为是一种很有前景的抗癌药物。ZD55能够靶向肝癌并且表现出明显的细胞毒性效应;然而,当其靶向肝癌干细胞时是否具有同样地杀伤效力仍需进一步探讨。我们利用悬浮培养的方法富集类肝癌干细胞,此种细胞具有肝癌干细胞的特征,如自我更新和分化能力、癌症干细胞相关转录因子上调和具有抗化疗作用等。本研究结果显示,ZD55在对类肝癌干细胞的细胞毒性效应和溶瘤效果方面具有很好的效果,ZD55在体外能够非常明显的诱导细胞凋亡。因此,ZD55可能会成为靶向肝癌干细胞的一种很有前景的治疗药物,为肝癌患者获得较好的临床结果。
【关键词】：溶瘤痘病毒 双基因 抗癌研究 ZD55 溶瘤腺病毒 类肝癌干细胞
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词8-11
• 第一章 携带IL24和MnSOD双基因溶瘤痘苗病毒抗癌作用研究11-43
• 1.1 引言11-13
• 1.1.1 癌症靶向基因病毒治疗11
• 1.1.2 溶瘤痘苗病毒简介11-12
• 1.1.2.1 溶瘤痘苗病毒的特点11-12
• 1.1.2.2 溶瘤痘苗病毒的改造12
• 1.1.3 IL24基因概述12-13
• 1.1.4 MnSOD基因概述13
• 1.1.5 实验目的和意义13
• 1.2 实验材料13-18
• 1.2.1 质粒与菌株13-14
• 1.2.2 痘苗病毒14
• 1.2.3 工具酶及生化试剂14-15
• 1.2.4 主要溶液及配制方法15-16
• 1.2.5 本实验所用到的细胞株16
• 1.2.6 实验仪器设备16-17
• 1.2.7 引物序列17-18
• 1.3 实验方法18-32
• 1.3.1 重组质粒构建常用方法18-20
• 1.3.2 重组质粒构建及病毒同源重组示意图20-23
• 1.3.3 重组质粒pCB-B18R-MnSOD的构建23-26
• 1.3.4 细胞的复苏26-27
• 1.3.5 细胞的传代27
• 1.3.6 细胞的冻存27
• 1.3.7 携带基因的溶瘤痘苗病毒OncoPox-MnSOD,OncoPox-IL24-MnSOD的包装27
• 1.3.8 药物筛选，，挑空斑筛选目的病毒27-28
• 1.3.9 病毒基因组的抽提28-29
• 1.3.10 痘苗病毒的鉴定29
• 1.3.11 痘病毒滴度测定29
• 1.3.12 Vero-Cre稳转细胞系的构建29-30
• 1.3.13 Western blot检测MnSOD蛋白表达水平30-31
• 1.3.14 MTT检测31
• 1.3.15 痘病毒的大量扩增及纯化31
• 1.3.16 统计学分析31-32
• 1.4 实验结果32-42
• 1.4.1 pCB-B18R-Loxp-gpt-EGFP-Loxp的左臂的构建及鉴定结果32-33
• 1.4.2 pCB-B18R的右臂的构架及鉴定结果33-34
• 1.4.3 pCB-B18R-MnSOD质粒的构建及鉴定34-35
• 1.4.4 溶瘤痘苗病毒OncoPox-IL24-MnSOD的包装35-36
• 1.4.5 OncoPox-IL24-MnSOD重组病毒的鉴定36-37
• 1.4.6 OncoPox-MnSOD重组病毒的鉴定37-38
• 1.4.7 Western blot检测OncoPox-IL24-MnSOD、OncoPox-MnSOD病毒中MnSOD蛋白水平表达38-39
• 1.4.8 Vero细胞puro最小剂量的筛选39
• 1.4.9 puro筛选Cre表达阳性细胞39-40
• 1.4.10 Western blot检测Vero-Cre稳转株Cre酶的表达40
• 1.4.11 MTT检测重组病毒对肿瘤细胞的杀伤效果40-41
• 1.4.12 Hoechst33342染色法检测细胞凋亡41-42
• 1.5.结论42-43
• 第二章 溶瘤腺病毒ZD55对类肝癌干细胞杀伤作用的研究43-58
• 2.1 引言43-44
• 2.2 实验材料44-45
• 2.2.1 试剂及试剂盒44
• 2.2.2 溶液配制44
• 2.2.3 抗体44
• 2.2.4 病毒44
• 2.2.5 细胞系44-45
• 2.2.6 主要的实验仪器45
• 2.3 实验方法45-47
• 2.3.1 类肝癌干细胞球的悬浮培养45
• 2.3.2 病毒的滴度测定45-46
• 2.3.3 克隆形成实验46
• 2.3.4 MTT实验检测细胞活性46
• 2.3.5 结晶紫染色法检测细胞毒性46
• 2.3.6 小室侵袭实验46-47
• 2.3.7 Westen bloting实验47
• 2.3.8 细胞周期检测47
• 2.3.9 统计学分析47
• 2.4 结果47-56
• 2.4.1 无血清悬浮培养可以获得Sphere细胞47-48
• 2.4.2 Western blot检测Huh7 sphere细胞里蛋白表达的变化情况48-49
• 2.4.3 Huh7 sphere细胞具有耐药性49
• 2.4.4 Huh7 sphere细胞处于静息状态49-50
• 2.4.5 Huh7 sphere具有分化能力50-51
• 2.4.6 Huh7 sphere具有更强的侵袭能力51
• 2.4.7 Huh7 sphere细胞对THO, ZD55没有耐药性51-52
• 2.4.8 ZD55对Huh7 sphere细胞杀伤作用52-53
• 2.4.9 ZD55能诱导Huh7 sphere细胞凋亡53-55
• 2.4.10 Western blot检测ZD55通过caspase途径诱导Huh7 sphere细胞凋亡55-56
• 2.5 结论56-58
• 参考文献58-61
• 致谢61

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本文编号：570002