FOXO1基因参与调控人肝癌细胞胰岛素抵抗的研究

发布时间：2017-07-31 10:20

  本文关键词：FOXO1基因参与调控人肝癌细胞胰岛素抵抗的研究

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【摘要】：目的:本实验选用人源肝癌细胞Hep G2细胞株,通过高浓度胰岛素诱导Hep G2细胞建立Hep G2胰岛素抵抗模型,分析不同浓度胰岛素条件下Hep G2肝细胞对糖原消耗量,确定胰岛素诱导的最佳诱导浓度和时间,检测在不同浓度和时间的胰岛素干预下,Hep G2肝细胞中FOXO1基因的表达差异以及FOXO1蛋白的表达差异,进而得出研究FOXO1基因是否参与调控肝癌细胞胰岛素抵抗。并且利用胰岛素增敏药物吡格列酮降低Hep G2细胞胰岛素抵抗程度,再次检测Hep G2肝细胞中FOXO1基因的表达差异以及FOXO1蛋白的表达差异,反面验证FOXO1基因是否直接调控参与调控肝癌细胞胰岛素抵抗。方法:培养人肝癌细胞(Hep G2),当细胞生长超过培养瓶底面85%以上面积,进行传代,以密度为1×105/ml分为6组,将细胞均匀的种植于96孔板中,待细胞贴壁后,去除培养液中血清成分进行培养即为同步化24小时后,对每组细胞使用不同浓度胰岛素进行干预,胰岛素浓度分别为1×10-5,1×10-6,1×10-7,1×10-8,1×10-9,1×10-10(单位mol/L)。干预24小时后,使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测各组细胞培养中葡萄糖含量,用MTT检测每孔细胞含量,标化细胞糖原消耗量,分析最佳浓度。重新将细胞以密度为1×105/ml分为3组,接种于96孔板,待细胞贴壁后,进行无血清培养即为同步化24小时后,对每组细胞使用最佳浓度胰岛素进行干预,对每组细胞分别采用不同时间进行诱导,分别为24h,36h,48h,使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测各组细胞中葡萄糖含量,MTT检测每孔细胞含量,标化细胞糖原消耗量。分析最佳时间。确定最佳时间,收集细胞,使用RT-PCR技术检测不同胰岛素干预组FOXO1基因表达,Western印迹法(WB)定量检测各组细胞FOXO1蛋白表达水平,验证FOXO1与胰岛素抵抗的相关性。用MTT法检测吡格列酮对细胞凋亡的影响,选取影响较低的浓度,对最佳浓度,最佳时间的胰岛素干预组,分别用不含吡格列酮的培养液和含不同浓度的吡格列酮培养液培养24h,使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测各组细胞中葡萄糖含量。选取最佳浓度的吡格列酮干预组,使用RT-PCR技术检测该组细胞FOXO1基因表达,Western印迹法(WB)定量检测各组细胞FOXO1蛋白表达水平,反向验证FOXO1与胰岛素抵抗的相关性,阐明FOXO1基因参与调控人肝癌细胞的胰岛素抵抗。结果:Hep G2细胞胰岛素抵抗模型的最佳诱导条件为10-7mol/L胰岛素处理36小时,胰岛素抵抗逆转模型诱导的最佳浓度为1.25mmol/L盐酸吡咯列酮处理24小时,细胞发生胰岛素抵抗时Fox O1基因与蛋白的表达均显著偏高,而发生胰岛素抵抗逆转时,Fox O1的表达则接近对照组水平。结论在体外诱导建立的胰岛素抵抗模型和胰岛素抵抗逆转模型中,细胞对胰岛素的敏感性与Fox O1基因的表达呈负相关,提示Fox O1有可能作为胰岛素增敏剂的药物筛选靶标及药效评估指标。
【关键词】：FOXO1 胰岛素抵抗 吡格列酮 人源肝癌细胞HepG2 2型糖尿病
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R781
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 第一章 前言9-16
• 1.1 研究背景9
• 1.2 糖尿病简介9-10
• 1.2.1 糖尿病分类9-10
• 1.3 胰岛素10-12
• 1.3.1 胰岛素的产生及功能10-11
• 1.3.2 胰岛素抵抗概念11
• 1.3.3 胰岛素抵抗机理11-12
• 1.4 胰岛素抵抗的逆转12
• 1.5 Foxo112-16
• 1.5.1 Foxo1的结构和人体类的分布12-13
• 1.5.2 Foxo1在糖代谢中的作用13
• 1.5.3 Foxo1与糖尿病的关系13-14
• 1.5.4 Foxo1与胰岛素抵抗14
• 1.5.5 Foxo1与口腔疾病的关系14-16
• 第二章 材料和方法16-24
• 2.1 仪器与试剂16-17
• 2.1.1 主要仪器16
• 2.1.2 主要试剂16-17
• 2.2 实验方法17-20
• 2.2.0 溶液配制17-19
• 2.2.1 细胞复苏19
• 2.2.2 细胞培养19
• 2.2.3 胰岛素抵抗细胞的诱导与建立19-20
• 2.3 实时荧光定量RT-PCR法检测FOXO1基因表达20-21
• 2.3.1 总RNA提取20-21
• 2.3.2 cDNA制备21
• 2.3.3 荧光定量PCR21
• 2.4 Western Blotting法检测蛋白质表达21-22
• 2.4.1 蛋白质的抽取及定量21
• 2.4.2 SDS-PAGE电泳21-22
• 2.4.3 转膜22
• 2.4.4 免疫反应22
• 2.5 糖原染色22-24
• 2.5.1 细胞爬片及干预处理22-23
• 2.5.2 细胞染色23
• 2.5.3 观察拍照23-24
• 第三章 实验结果24-34
• 3.1 不同浓度胰岛素作用不同时间对HepG2细胞葡萄糖标准消耗量的影响24-29
• 3.2 不同浓度盐酸吡格列酮对胰岛素抵抗逆转后细胞存活率的影响29
• 3.3 各组细胞FoxO1基因的表达29-31
• 3.4 各组细胞FoxO1蛋白的表达31-32
• 3.5 糖原检测半定量结果32-34
• 第四章 讨论34-39
• 参考文献39-43
• 致谢43

【参考文献】

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本文编号：598672