菊花‘毛香玉’花对称性调控CmDIV基因克隆及分析

发布时间：2017-07-31 10:04

  本文关键词：菊花‘毛香玉’花对称性调控CmDIV基因克隆及分析

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【摘要】：花对称性是植物重要观赏性状,在吸引昆虫授粉、保护雌雄蕊方面有重要作用,同时有利于提高植物的观赏和经济价值。菊花是一种广泛应用的商品花卉,其独特的头状花序同时包含舌状花和管状花两种形式,舌状花为两侧对称形式,管状花为辐射对称形式。目前,国内外有关花对称的研究主要集中在发育生物学、传粉生物学及生殖生物学上,焦点聚集在花瓣形态建成的分子机制的探索上。本论文采用RT-PCR结合RACE的方法,以菊花‘毛香玉’(Chrysanthemum morifolium 'maoxiangyu')花序为材料,克隆得到花对称性调控相关DIV基因,运用荧光定量PCR分析该基因在不同组织器官中的表达规律,并进行转化拟南芥观测表型来研究该基因功能,主要结论如下：1.利用RT-PCR结合RACE技术,从菊花‘毛香玉’花序中克隆得到一条花对称性调控基因,命名为CmDⅣ, GeneBank登录号为KU871013。生物信息学分析表明,该基因包含879bp的开放阅读框,编码292个氨基酸,编码蛋白质分子质量为32.83kD,等电点为9.16,分子式为C2632H4387N879O1104S138。系统进化树分析显示CmDⅣ蛋白与其他植物的花对称性调控DIV基因蛋白同源性多集中在55%-70%,与忍冬科七子花HmDⅣ (ACR09740.1)蛋白亲缘性最近为73%。该蛋白具有两个SANT结构域,分别由约50个氨基酸构成,是一种典型的R2R3MYB转录因子。2.荧光定量PCR表达结果显示,在菊花“毛香玉”中CmDⅣ基因在辐射对称的管状花中表达量最高,其次是花器官的花序柄和苞片,在两侧对称的舌状花中表达量较低,其表达量约为管状花的三分之一,且CmDⅣ基因在营养器官的茎、叶中均有表达,表达量略低于舌状花。对两个野生种(毛华菊、甘菊)和三个品种(‘国庆小六号’、‘优十’、‘铺地淡粉’)的管状花和舌状花的荧光定量PCR分析显示,均有管状花表达量高于舌状花的现象,推测该基因在菊花花对称性调控通路中发挥有作用,且在管状花中调控作用更大。3.构建植物表达载体PCAMBIA1304-DⅣ,运用农杆菌侵染花序的方法将CmDⅣ基因的表达载体转入拟南芥,通过潮霉素及RT-PCR检测,共筛选出4个转基因株系。表型观测发现转基因拟南芥植株较低矮,叶片较小且圆,花对称性类型仍为辐射对称,其他性状与野生型拟南芥差别不大,推测CmDⅣ基因在控制花对称性调控上功能相对较弱,并未引起转基因拟南芥花对称性变化可能是CmDⅣ基因存在功能冗余或该基因功能发生分化造成的。本论文从‘菊花‘毛香玉’花序中克隆得到一条花对称性调控基因CmDⅣ,对CmDⅣ基因表达情况进行了初步分析,并将CmDⅣ转入拟南芥中观测表型变化,对基因功能进行综合研究,为后期研究菊花花对称性分子机理的研究打下基础。
【关键词】：菊花 花对称性 基因克隆 表达分析 基因转化
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S682.11
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 引言11-21
• 1.1 植物花对称性概述11-12
• 1.2 观赏植物花对称性调控的分子机理12-14
• 1.3 MYB转录因子家族特点14-15
• 1.4 花型改良基因工程研究15-16
• 1.5 菊科植物花对称性调控基因的克隆与表达16-18
• 1.6 本研究的设计思想18-21
• 1.6.1 研究的目的和意义18
• 1.6.2 研究内容18
• 1.6.3 技术路线18-21
• 2 菊花‘毛香玉’花对称性调控基因克隆与序列分析21-39
• 2.1 实验材料21-22
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 主要试剂21
• 2.1.3 试验引物21-22
• 2.2 实验方法22-29
• 2.2.1 菊花‘毛香玉’花序总RNA提取与质量检测22-23
• 2.2.2 第一链cDNA的合成23
• 2.2.3 CmDIV基因3'RACE克隆23-26
• 2.2.4 CmDIV基因5'RACE克隆26-27
• 2.2.5 CmDIV基因的克隆27-29
• 2.2.6 CmDIV基因生物信息学分析29
• 2.3 结果与分析29-38
• 2.3.1 总RNA的提取29-30
• 2.3.2 CmDIV基因克隆与序列测定30-32
• 2.3.3 CmDIV基因生物信息学分析32-38
• 2.4 讨论38-39
• 3 CmDIV基因荧光定量表达分析39-47
• 3.1 实验材料39
• 3.1.1 植物材料与取样39
• 3.1.2 试剂39
• 3.1.3 主要仪器39
• 3.2 实验方法39-41
• 3.2.1 各样品总RNA提取及cDNA第一链的合成40
• 3.2.2 引物设计40
• 3.2.3 荧光定量PCR反应40-41
• 3.3 结果与分析41-44
• 3.3.1 总RNA提取检测41
• 3.3.2 溶解曲线分析41-42
• 3.3.3 CmDIV基因在菊花‘毛香玉’盛花期不同组织部位的表达42-43
• 3.3.4 CmDIV基因在菊花不同种与品种间的表达差异43-44
• 3.4 讨论44-47
• 4 CmDIV基因转化拟南芥及表型观测47-57
• 4.1 试验材料与试剂47
• 4.1.1 试验材料与试剂47
• 4.2 试验方法47-51
• 4.2.1 CmDIV基因序列加酶切位点47
• 4.2.2 植物表达载体的构建47-48
• 4.2.3 农杆菌感受态的制备48-49
• 4.2.4 植物表达载体转化农杆菌49
• 4.2.5 拟南芥培养49
• 4.2.6 花序侵染法转化拟南芥及转基因株系鉴定49-51
• 4.3 结果与分析51-53
• 4.3.1 植物表达载体构建51
• 4.3.2 转基因拟南芥检测51-52
• 4.3.3 转基因拟南芥RT-PCR检测52
• 4.3.4 转基因拟南芥表型观测52-53
• 4.4 讨论53-57
• 5 总结57-59
• 5.1 结论57
• 5.1.1 CmDIV基因克隆及分析57
• 5.1.2 CmDIV基因荧光定量及分析57
• 5.1.3 CmDIV基因转导拟南芥表型观测57
• 5.2 展望57-59
• 本研究创新之处59-61
• 参考文献61-67
• 个人简介67-69
• 导师简介69-71
• 获得成果71-73
• 致谢73

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1 刘轶奇;菊花‘毛香玉’花对称性调控CmDIV基因克隆及分析[D];北京林业大学;2016年

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本文编号：598585