基于转录组测序盐生草（Halogeton glomeratus）耐盐基因的克隆与验证

发布时间：2017-08-02 14:07

  本文关键词：基于转录组测序盐生草（Halogeton glomeratus）耐盐基因的克隆与验证

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【摘要】：盐碱土是我国重要的土地资源。盐胁迫是全球范围内的非生物胁迫之一,影响植物的正常生理活动。盐生植物能够在高盐碱的环境中自由生长,在我国资源利用中具有重要的经济价值。探寻盐生植物的耐盐机理、筛选耐盐基因和耐盐品种已逐渐成为耐盐碱方法中更为经济有效的一部分。盐生草(Halogeton glomeratus)属于藜科盐生草属一年生植物,主要分布于甘肃、青海等地的荒漠和盐碱地。从生理学角度分析表明,盐生草在盐胁迫下表现较强的耐盐性。经盐胁迫后,叶肉细胞的液泡中可以积累大量钠离子。从分子生物学角度研讨盐生草耐盐机理,挖掘耐盐基因,对培育耐盐新品种具有重要意义。本实验是在盐胁迫后盐生草转录组测序的基础上,筛选了4个经盐胁迫后表达上调的基因进行研究,本研究的实验内容和结果如下:(一)通过3’RACE技术,获取了三个基因的3’端序列,经拼接后,获得Unigene22136片段长为609bp、Unigene33874片段长为471p和Unigene34165片段长为760bp。(二)利用3’RACE和5’RACE技术获取了CL5227基因的cDNA全长,该基因全长为501bp,其中包括208bp的5’UTR区和164bp的3’UTR区,开放阅读框长为129bp,编码42个氨基酸,其分子量为4.56kD,经生物信息学分析表明,CL5227基因蛋白属于疏水性碱性蛋白,该蛋白无信号肽及跨膜区;经亚细胞定位预测初步定位于线粒体内,分析推测其具有生长因子、结构蛋白等功能。(三)从盐生草中克隆得到CL5227基因,并成功构建了植物表达载体pCAMBIA3300-CL5227,将其成功导入农杆菌LBA4404;通过蘸花法侵染转化拟南芥,通过初步筛选与PCR鉴定获得T1代抗性植株。为进一步进行基因功能鉴定奠定了基础。
【关键词】：盐生草 盐胁迫 RACE 植物表达载体
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要2-3
• Summary3-5
• 缩略词表5-9
• 第一章 文献综述9-19
• 1.1 植物的耐盐机制9-12
• 1.1.1 渗透调节9-10
• 1.1.2 离子区隔化10-11
• 1.1.3 活性氧的清除11
• 1.1.4 光合途径的改变11
• 1.1.5 激素与蛋白调节11-12
• 1.1.6 植物个体应对盐胁迫的方式12
• 1.2 植物耐盐基因的研究12-13
• 1.3 新一代高通量测序技术13-14
• 1.3.1 转录组Denovo测序14
• 1.4 新基因全长cDNA克隆策略14-16
• 1.4.1 图位克隆15
• 1.4.2 电子基因克隆15
• 1.4.3 cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）15-16
• 1.5 盐生植物研究进展16-17
• 1.6 本研究的目的意义17-18
• 技术路线18-19
• 第二章 盐生草耐盐相关基因的克隆19-45
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 主要仪器设备19
• 2.1.4 PCR引物设计与合成19-21
• 2.2 试验方法21-29
• 2.2.1 盐生草总RNA的提取与检测21-22
• 2.2.2 cDNA第一条链的制备22
• 2.2.3 3’race模板的制备22-23
• 2.2.4 5’race模板的制备23-24
• 2.2.5 盐生草耐盐相关基因的克隆24-26
• 2.2.6 基因的测序及全长序列的拼接26-29
• 2.2.7 目的基因的生物信息学分析29
• 2.3 实验结果与分析29-43
• 2.3.1 总RNA的提取及质量检测29-30
• 2.3.2 盐生草Unigene22136基因的克隆与序列拼接30-31
• 2.3.3 盐生草Unigene 33874 基因的克隆与序列拼接31-33
• 2.3.4 盐生草Unigene34165基因的克隆与序列拼接33-34
• 2.3.5 盐生草Cl5227基因的克隆与序列拼接34-36
• 2.3.6 盐生草Cl5227基因的生物信息学分析36-43
• 2.4 讨论43-45
• 2.4.1 盐生草Cl5227基因的蛋白功能确定43-44
• 2.4.2 实验后期展望44-45
• 第三章 盐生草Cl5227基因植物表达载体的构建及转化45-58
• 3.1 实验材料45
• 3.1.1 植物材料45
• 3.1.2 主要试剂45
• 3.1.3 载体与菌株45
• 3.1.4 主要仪器设备45
• 3.1.5 引物设计与合成45
• 3.2 实验方法45-52
• 3.2.1 盐生草总RNA的提取与检测45-46
• 3.2.2 cDNA第一条链的制备46
• 3.2.3 目的基因的扩增46
• 3.2.4 目的基因的回收46
• 3.2.5 目的基因连接克隆载体46-47
• 3.2.6 植物表达载体pCAMBIA3300-Cl5227的构建47-49
• 3.2.7 植物表达载体pCAMBIA3300- Cl5227的农杆菌转化49-50
• 3.2.8 侵染法转化拟南芥50-52
• 3.3 实验结果与分析52-57
• 3.3.1 盐生草Cl5227基因全长的获得52-53
• 3.3.2 中间载体双酶切鉴定53-54
• 3.3.3 表达载体pCAMBIA3300-Cl5227的鉴定54-55
• 3.3.4 pCAMBIA3300-Cl5227转化农杆菌55
• 3.3.5 拟南芥的遗传转化55-56
• 3.3.6 转基因植株的PCR鉴定56-57
• 3.4 讨论57-58
• 第四章 结论58-59
• 参考文献59-67
• 致谢67-68
• 导师简介68-69
• 作者简介69

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本文编号：609635