RNA干扰Bloom解旋酶基因表达对人前列腺癌PC3细胞生物学特性的影响

发布时间：2017-08-02 18:17

  本文关键词：RNA干扰Bloom解旋酶基因表达对人前列腺癌PC3细胞生物学特性的影响

  更多相关文章： Bloom解旋酶 RNAi 人前列腺癌PC3细胞 增殖 迁移 侵袭 凋亡

【摘要】：RecQ解旋酶家族是DNA解旋酶家族中高度保守的家族,在DNA复制、重组、修复、转录等细胞代谢和稳定遗传中起到至关重要的作用。Bloom解旋酶是RecQ家族中的一个重要的组成成员,它参与了DNA的复制、重组等细胞代谢过程,在维持端粒和染色体的稳定性中也发挥着重要作用,并且其能够与多种蛋白因子发生相互作用,影响与之作用的因子的功能。Bloom解旋酶基因的突变可导致Bloom综合征的发生,Bloom综合征是一种罕见隐性常染色体遗传疾病,患者不仅遗传不稳定,并且易患多种类型癌症。在DNA修复和细胞凋亡过程中,涉及到对DNA损坏和使复制叉停止的细胞应答。对DNA修复因子-BLM解旋酶的特异性抑制作用可能缓解癌细胞的高增殖率,暗示这种酶可能作为抗癌药物作用的分子靶标。本论文构建了Bloom解旋酶基因的RNA干扰载体,研究了其载体对人类前列腺癌PC3细胞生物学特性的影响,这可能为人类前列腺癌的靶向基因治疗提供新思路,相关研究结果如下:1.构建了Bloom解旋酶基因的RNAi载体,经转化大肠杆菌感受态细胞克隆该载体,琼脂糖凝胶电泳和DNA测序证实了构建载体正确2.将构建的载体通过脂质体法转染进人前列腺癌PC3细胞中,转染一定时间后,提取细胞总RNA,反转录成cDNA,提取细胞总蛋白。用cDNA做模板进行荧光定量PCR实验,用定量后的总蛋白做模板进行蛋白质印迹(western-blot)实验。从基因和蛋白水平证明了该载体能够有效抑制Bloom解旋酶的表达。3.MTT、划痕实验、transwell小室实验检测、Hoechst/PI双染实验证明分别证明了Bloom解旋酶的表达被抑制后,人类前列腺癌PC3细胞的增殖、迁移、侵袭能力均受到抑制,而PC3细胞的凋亡能力加强。
【关键词】：Bloom解旋酶 RNAi 人前列腺癌PC3细胞 增殖 迁移 侵袭 凋亡
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-22
• 1.DNA解旋酶概述10-14
• 1.1 DNA解旋酶的分类10-11
• 1.2 DNA解旋酶的生化活性及功能11-14
• 1.2.1 核酸结合活性11-12
• 1.2.2 NTP结合与水解活性12
• 1.2.3 解链活性12-13
• 1.2.4 退火活性13
• 1.2.5 DNA解旋酶的功能13-14
• 2.RecQ解旋酶结构与生物学特性14
• 3.Bloom解旋酶的研究进展14-16
• 3.1 Bloom解旋酶的功能15
• 3.2 与Bloom解旋酶相关的疾病研究15-16
• 4.人类前列腺癌的发生与Bloom解旋酶作为抗癌靶标的研究16-18
• 5.RNA干扰技术的应用18-20
• 6.本课题的选题目的及研究意义20-22
• 第二章 Bloom解旋酶基因RNAi载体的构建22-27
• 1.试剂与设备22-23
• 1.1 实验试剂22-23
• 1.2 实验设备23
• 2.实验方法23-25
• 2.1 RNAi载体的设计合成23-24
• 2.2 感受态细胞的制备24-25
• 2.3 干扰载体的克隆转化25
• 3.实验结果25
• 4.讨论25-27
• 第三章 Bloom解旋酶基因RNAi载体的鉴定27-46
• 1.干扰载体的初步鉴定27-30
• 1.1 实验试剂27
• 1.2 实验方法27-28
• 1.3 实验结果28-30
• 2. 荧光定量PCR检测干扰载体对Bloom解旋酶基因表达的影响30-41
• 2.1 试剂与设备30-31
• 2.1.1 实验试剂30-31
• 2.1.2 实验设备31
• 2.2 实验方法31-36
• 2.2.1 PC3细胞的培养31-32
• 2.2.2 无内毒素质粒的提取32-33
• 2.2.3 重组载体转染PC3细胞33
• 2.2.4 转染重组载体后PC3细胞总RNA的提取与RNA的反转录33-34
• 2.2.5 转染后细胞c DNA的荧光定量PCR反应34-36
• 2.3 实验结果36-41
• 3. 蛋白质印迹技术检测干扰载体对Bloom解旋酶蛋白表达的影响41-44
• 3.1 试剂与设备41
• 3.1.1 实验试剂41
• 3.1.2 实验设备41
• 3.2 实验方法41-44
• 3.2.1 PC3细胞的培养41
• 3.2.2 重组载体转染PC3细胞41
• 3.2.3 转染后细胞总蛋白的提取及总蛋白的定量41-43
• 3.2.4 定量后总蛋白的Western-blot反应43-44
• 3.3 实验结果44
• 4.讨论44-46
• 第四章 下调Bloom解旋酶的表达对PC3细胞的抑制作用46-58
• 1.试剂与设备46-47
• 1.1 实验试剂46-47
• 1.2 实验设备47
• 2.实验方法47-49
• 2.1 PC3细胞的培养47
• 2.2 重组载体转染PC3细胞47
• 2.3 PC3细胞增殖能力的检测47
• 2.4 PC3细胞侵袭能力的检测47-48
• 2.5 PC3细胞迁移能力的检测48
• 2.6 PC3细胞凋亡能力的检测48-49
• 3.实验结果49-56
• 3.1 PC3细胞增殖能力的变化49-50
• 3.2 PC3细胞侵袭能力的变化50-51
• 3.3 PC3细胞迁移能力的变化51-54
• 3.4 PC3细胞凋亡能力的变化54-56
• 4.讨论56-58
• 第五章 结论58-59
• 参考文献59-71
• 致谢71-73
• 附录73-74

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本文编号：610617