猪卵母细胞体外成熟调控和MPF、MAPK基因表达研究

发布时间：2017-08-05 21:13

  本文关键词：猪卵母细胞体外成熟调控和MPF、MAPK基因表达研究

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【摘要】：本试验对猪卵母细胞体外成熟及受精技术体系展开了一系列研究,以期获得高质量成熟卵母细胞,降低精子多精入卵现象,提高胚胎可移植效率,从而建立高效的人工授精胚胎体外生产技术体系。1、促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育的影响。本研究旨在探讨不同浓度的促性腺激素(FSH、LH)以及处理时间对猪卵母细胞体外成熟质量及其后期发育潜力的影响。试验中,培养液中FSH、LH浓度均为10ug/m L且处理42h为对照组A,猪卵母细胞在不同浓度促性腺激素以及处理时间中培养42 h后,通过猪卵母细胞核的进程、存活率、极体率以及卵子内谷胱甘肽(GSH)含量等质量指标的评价,探讨成熟液中促性腺激素的最佳添加量以及处理的时间,再通过孤雌胚体外发育潜力研究,进一步验证该成熟培养体系。结果表明,4组卵子成熟培养42h都能到达核成熟阶段,存活率和极体率之间差异均不显著(P0.05);试验组单个卵母细胞内GSH含量显著高于对照组A(P0.05),其中全程添加FSH和LH,且浓度为1ug/m L的组别单个卵母细胞内GSH含量最高。此外,全程添加FSH和LH,且浓度为1ug/m L的试验组孤雌激活后卵裂率和囊胚率均显著高于对照组(P0.05)。试验结果证明,在猪卵母细胞体外成熟液中全程添加促性腺激素且浓度为1ug/mL,可显著提高卵子成熟质量及后期发育潜力。2、褪黑素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育的影响。探讨成熟液中不同浓度褪黑素对猪卵母细胞体外成熟质量及其后期发育潜力的影响。试验中,0mol/L为对照组,猪卵母细胞在不同MT浓度(0mol/L、10-6mol/L、10-9mol/L和10-12mol/L)的成熟液中培养42 h后,通过猪卵母细胞存活率、极体率、卵子内谷胱甘肽(GSH)含量以及胞质内线粒体和脂肪颗粒成熟分布状态等质量指标的评价,探讨成熟液中褪黑素(melatonin,MT)最佳添加量,再通过孤雌胚体外发育潜力研究,进一步验证该成熟培养体系。结果表明,4组卵子存活率和极体率之间差异均不显著(P0.05);试验组单个卵子中GSH含量均显著高于对照组(P0.05);而且,试验组卵子内脂肪颗粒和线粒体成熟分布等质量指标也显著优于对照组(P0.05);此外,孤雌激活后10-6mol/L和10-9mol/L组卵裂率和囊胚率均显著高于对照组(P0.05)。试验结果证明,在猪卵母细胞体外成熟液中添加10-9mol/L-10-6mol/L的MT,可显著提高卵子成熟质量及后期发育潜力。3、褪黑素对卵母细胞MPF和MAPK基因表达的影响。试验采用两种提取RNA的提取方法,并对不同浓度下培养的卵母细胞内MPF和MAPK基因的mRNA表达进行分析。结果表明体外成熟培养液中褪黑素浓度为10-9mol/L时,成熟的卵母细胞中的MPF和MAPK基因mRNA表达量同时上调,且显著高于对照组(P0.05)。4、咖啡因对猪精子获能以及体外受精的影响。试验探讨了不同浓度咖啡因对猪精子活力、存活时间以及体外受精的影响。试验中,0 mmol/L为对照组,猪精子在不同浓度咖啡因(0、2.5、5、10、20mmol/L)的受精液中获能,每隔30min对精子的活力进行测定,直至活力低于0.6.选择活力最强时候的时间点进行体外受精。结果表明:(1)咖啡因浓度为10、20mmol/L组,获能90min后精子活力明显低于0.6,其他组精子活力均要高于0.6;(2)咖啡因可以显著提高精子入卵率,咖啡因浓度为20mmol/L时多精入卵率显著高于对照组(P0.05);(3)咖啡因浓度为2.5~5.0mmol/L时,更有利于后期胚胎发育。体外成熟培养体系的建立,提高了卵母细胞成熟的质量,对猪胚胎生物技术方面研究具有重要的参考价值。
【关键词】：卵母细胞 促性腺激素 褪黑素 体外成熟 MFP MAPK 猪
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要11-13
• Abstract13-16
• 第一章 引言16-30
• 1 猪卵母细胞体外成熟研究进展16-25
• 1.1 卵母细胞的体外成熟特征16-17
• 1.2 谷胱甘肽、线粒体及脂肪颗粒与卵母细胞成熟的关系17-19
• 1.3 卵母细胞成熟过程中MPF和MAPK的变化规律19-21
• 1.4 影响卵母细胞体外成熟的因素21-24
• 1.5 培养条件24-25
• 2 猪卵母细胞体外受精研究进展25-28
• 2.1 精子获能25-27
• 2.2 精子获能效果的评定27-28
• 3 孤雌激活28-29
• 4 早期胚胎的体外培养29-30
• 第二章 促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育的影响30-42
• 1 材料与方法30-35
• 1.1 试验材料30
• 1.2 试剂及仪器设备30
• 1.3 主要溶液配制30-32
• 1.4 方法32-34
• 1.5 试验设计34
• 1.6 统计分析34-35
• 2 结果与分析35-39
• 2.1 不同浓度的促性腺激素和处理时间对猪卵母细胞核成熟的影响35-37
• 2.2 不同浓度的促性腺激素和处理时间对猪卵母细胞存活率以及极体率的影响37
• 2.3 不同浓度的促性腺激素和处理时间对猪卵母细胞内谷胱甘肽含量影响的研究37-38
• 2.4 猪卵母细胞孤雌胚发育潜力研究38-39
• 3 讨论39-41
• 3.1 不同浓度促性腺激素和处理时间对卵母细胞核成熟的影响39-40
• 3.2 不同浓度促性腺激素和处理时间对GSH含量的影响40-41
• 4 小结41-42
• 第三章 褪黑素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育的影响42-48
• 1 材料与方法42-43
• 1.1 试验材料42
• 1.2 主要试剂的配制42
• 1.3 试验方法42-43
• 1.4 试验设计43
• 1.5 统计分析43
• 2 结果与分析43-47
• 2.1 褪黑素对猪卵母细胞活率和极体率影响的研究43-44
• 2.2 褪黑素对猪卵母细胞内谷胱甘肽含量影响的研究44
• 2.3 猪卵母细胞脂肪颗粒和线粒体成熟分布状态研究44-46
• 2.4 猪卵母细胞孤雌胚发育潜力研究46-47
• 3 讨论47
• 3.1 褪黑素对猪卵母细胞活率和极体率影响的研究47
• 3.2 褪黑素对猪卵母细胞胞质内容物影响的研究47
• 4 小结47-48
• 第四章 褪黑素对卵母细胞MPF和MAPK基因表达的影响48-57
• 1 材料与方法48-51
• 1.1 试验材料48
• 1.2 试剂及仪器设备48
• 1.3 试验方法48-51
• 1.4 数据分析51
• 2 结果与分析51-55
• 2.1 两种提取方法RNA纯度分析51-52
• 2.2 溶解曲线和扩增曲线52-55
• 3 讨论55-56
• 3.1 两种提取RNA方法的比较55
• 3.2 褪黑素作用卵母细胞MPF和MAPK基因mRNA的表达55-56
• 4 小结56-57
• 第五章 咖啡因对猪精子获能以及体外受精的影响57-62
• 1 材料与方法57-59
• 1.1 材料57
• 1.2 主要试剂的配制57-58
• 1.3 方法58
• 1.4 试验设计58
• 1.5 统计分析58-59
• 2 结果与分析59-60
• 2.1 咖啡因对精子不同时间活力的影响59
• 2.2 咖啡因对体外受精影响59-60
• 3 讨论60-61
• 3.1 咖啡因对卵母细胞活力及存活时间的影响60-61
• 3.2 咖啡因对精子体外受精的影响61
• 4 小结61-62
• 结论62-63
• 参考文献63-72
• 致谢72-73
• 攻读硕士期间发表的论文73

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