农杆菌介导LYZ-GFP双元基因对3个苜蓿品种的转化及其表达分析

发布时间：2017-08-06 15:06

  本文关键词：农杆菌介导LYZ-GFP双元基因对3个苜蓿品种的转化及其表达分析

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【摘要】：苜蓿(Medicago sativa L.)是目前我国种植最广的豆科牧草,尤其在西北、华北和东北的苜蓿主产区,但是病害往往威胁着苜蓿的生产,病发严重可造成大面积减产,极大地限制了优良牧草在畜牧业中的利用与营养潜力的发挥。为此,本研究以甘农1号杂花苜蓿、甘农3号紫花苜蓿,及和田紫花苜蓿为供试材料,优化了3个品种的植株再生体系;利用农杆菌介导法将LYZ-GFP双元基因导入3个苜蓿品种中,并分析了转化过程中的各影响因素,优化了遗传转化条件;对获得的转化植株进行了荧光检测和目的基因PCR检测,成功获得了具有目的基因(溶菌酶基因)的甘农1号及和田苜蓿的转基因植株,为转基因抗病苜蓿新品种的最终形成奠定了研究基础。具体研究内容及结果如下:。1.进行3个苜蓿品种植株再生和遗传转化的研究,优化了苜蓿再生体系和遗传转化条件。以苜蓿3个品种的下胚轴为外植体,进行消毒方式对种子消毒效果、愈伤组织诱导、分化及遗传转化影响因素的研究。结果表明:品种G1、G3、HT最适的消毒方式为20%次氯酸钠处理25min,该处理条件下三者发芽率均最高,分别是93%、84%、97.5%;获得3个苜蓿品种愈伤组织诱导和分化的较成熟体系,MS培养基+2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT处理条件下,G1、G3、HT的出愈率分别为98.5%、90%、99.5%;在愈伤分化阶段,当NAA浓度为0.5mg/L时,G1和G3的分化率达到最大,分别为74%和47%,当NAA浓度为0.05mg/L时,HT分化率最大,为62%。2.探索了三个苜蓿品种试管苗微繁的最适浓度生长调节剂,优化了适宜转基因试管苗大量扩繁的稳定条件本试验以甘农3号(G3)、和田(HT)、陇东(LD)紫花苜蓿为材料,研究不同种类和浓度的生长调节剂吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、生根粉(ABT)对苜蓿微扦插试管苗生长的影响。结果表明:0.2mg/LNAA处理下的甘农3号紫花苜蓿试管苗生根率达100%,且具有较高的生根数(8),最大根长(17.5cm),株高和叶片数也显著高于对照(CK)和其他处理(P0.05);0.1mg/LNAA处理下的和田紫花苜蓿试管苗的根系生长情况明显优于其他处理,生根率为100%,具有较高的生根数(7),最大根长(29.6cm),株高和叶片数也显著高于对照(CK)和其他处理(P0.05);0.2mg/LNAA处理下的陇东紫花苜蓿试管苗的根系生长情况明显优于其他处理,生根率100%,并具有较高的生根数(7),最大根长(10.2cm),株高和叶片数也显著高于对照(CK)和其他处理(P0.05)。因此,在设置的浓度梯度下,甘农3号和陇东紫花苜蓿微扦插试管苗生长的最适生长调节剂及其浓度是0.2mg/LNAA,适于和田紫花苜蓿的是0.1mg/LNAA。3.获得了含有目的基因的转基因植株,经PCR和荧光定量检测,取得了阳性证据。对转化植株进行荧光检测和PCR检测,筛选含有LYZ-GFP双元基因的转基因植株荧光跟踪显微检测,发现G1、G3、HT的愈伤组织均存在发绿色荧光的愈伤组织;对G1和HT抗性植株进行叶片荧光检测,检测结果显示,叶片发绿色荧光;提取荧光检测呈阳性的G1和HT抗性植株DNA,进行GFP基因和LYZ基因PCR扩增分析,结果显示:6株甘农1号杂花苜蓿荧光检测阳性植株经PCR扩增后,均出现750bp的GFP基因条带,其中4株扩增后出现500bp的LYZ基因条带,1株和田扩增出500bp的Lyz基因条带。
【关键词】：苜蓿 农杆菌介导 绿色荧光蛋白GFP基因 溶菌酶Lyz基因 愈伤组织分化 植株再生 生长调节剂 荧光检测 转基因植株
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S541.9
【目录】：

• 项目来源2-3
• 摘要3-5
• SUMMARY5-10
• 缩写词(ABBREVIATION)10-11
• 前言11-13
• 第一章 文献综述13-30
• 1 苜蓿转基因研究进展13-23
• 1.1 苜蓿再生体（组织培养）研究进展13-15
• 1.2 苜蓿遗传转化受体研究进展15-17
• 1.2.1 愈伤组织再生系统16
• 1.2.2 原生质体受体系统16-17
• 1.2.3 胚状体再生系统17
• 1.2.4 直接分化再生系统17
• 1.2.5 生殖细胞受体系统17
• 1.3 苜蓿遗传转化研究进展17-22
• 1.3.1 农杆菌介导法在苜蓿中的应用18-20
• 1.3.2 基因枪法20
• 1.3.3 DNA直接转移导入原生质体20-21
• 1.3.4 显微注射法21
• 1.3.5 花粉管通道法21-22
• 1.4 苜蓿抗病性遗传转化研究进展22-23
• 2 绿色荧光蛋白基因及其应用23-26
• 2.1 绿色荧光蛋白（GFP）基因的结构及其发光机理23-24
• 2.2 GFP在转基因研究中作为标记基因的几个优点24-25
• 2.3 GFP在转基因研究中的应用25-26
• 3 溶菌酶的应用进展26-29
• 3.1 溶菌酶的结构、理化性质及其抗菌作用26-27
• 3.2 溶菌酶的分类27
• 3.2.1 植物溶菌酶27
• 3.2.2 动物溶菌酶27
• 3.2.3 微生物溶菌酶27
• 3.2.4 噬菌体溶菌酶27
• 3.3 溶菌酶的应用27-29
• 3.3.1 溶菌酶在食品上的应用28
• 3.3.2 溶菌酶在医药上的应用28
• 3.3.3 溶菌酶在生物工程上的应用28-29
• 4 本课题的研究目的与意义29-30
• 第二章 紫花苜蓿高效再生体系的建立和优化30-36
• 2.1 试验材料30
• 2.1.1 植物材料30
• 2.1.2 试验试剂与植物激素30
• 2.1.3 主要试验仪器30
• 2.1.4 培养基30
• 2.2 试验方法30-32
• 2.2.1 种子消毒以及外植体的获得30-32
• 2.2.2 愈伤组织诱导培养32
• 2.2.3 愈伤组织分化培养32
• 2.2.4 再生植株移栽32
• 2.2.5 数据处理32
• 2.3 结果与分析32-34
• 2.3.1 消毒方式对种子污染情况及发芽率的影响32-33
• 2.3.2 愈伤组织诱导33-34
• 2.3.3 愈伤组织分化34
• 2.4 讨论34-36
• 2.4.1 苜蓿种子消毒方式分析34-35
• 2.4.2 苜蓿愈伤诱导35
• 2.4.3 苜蓿愈伤组织分化35-36
• 第三章 生长调节剂对苜蓿微扦插试管苗生长的影响36-44
• 3.1 供试材料36
• 3.2 试验方法36-37
• 3.2.1 试管苗插穗的获得36
• 3.2.2 不同浓度生长调节剂及测定指标36-37
• 3.2.3 数据处理37
• 3.3 结果与分析37-42
• 3.3.1 生长调节剂对甘农3号（G3）紫花苜蓿微扦插试管苗生长状况的影响37-39
• 3.3.2 生长调节剂对和田（HT）紫花苜蓿微扦插试管苗生长状况的影响39-40
• 3.3.3 生长调节剂对陇东（LD）紫花苜蓿微扦插试管苗生长状况的影响40-42
• 3.4 讨论42-44
• 第四章 苜蓿遗传转化体系的优化44-48
• 4.1 试验材料44
• 4.1.1 材料44
• 4.1.2 生化试剂44
• 4.1.3 农杆菌培养基44
• 4.1.4 主要试验仪器44
• 4.2 试验方法44-45
• 4.2.1 工程菌的纯化及农杆菌侵染液的制备44-45
• 4.2.2 侵染受体材料的确定45
• 4.2.3 选择压卡那霉素（Kan）浓度的确定45
• 4.3 结果与分析45-47
• 4.3.2 侵染受体材料的确定45-46
• 4.3.3 选择压卡那霉素（Kan）浓度的确定46-47
• 4.4 讨论47-48
• 4.4.1 农杆菌侵染的受体材料的优化47
• 4.4.2 卡那霉素（Kan）有效浓度分析47-48
• 第五章 转化植株的荧光检测与目的基因的PCR检测48-55
• 5.1 试验材料48
• 5.1.1 植物材料48
• 5.1.2 试验仪器48
• 5.2 试验方法48-50
• 5.2.1 荧光检测48
• 5.2.2 PCR检测48-50
• 5.3 结果与分析50-53
• 5.3.1 荧光检测50-51
• 5.3.2 PCR检测51-53
• 5.4 讨论53-55
• 第六章 结论与展望55-57
• 6.1 结论55-56
• 6.2 展望56-57
• 参考文献57-63
• 附图63-64
• 致谢64-65
• 作者简介65-66
• 导师简介66-67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 范林林;林楠;冯叙桥;王晶晶;杨文晶;许泰百;;溶菌酶及其在食品工业中的应用[J];食品与发酵工业;2015年03期

2 邓一飞;张露娜;吴宜成;陈沁;邓志瑞;;培养基成分和培养时间对匍匐翦股颖植株再生的影响[J];广西植物;2013年06期

3 张树振;金j;周虹;韩春芳;杨龙;王晓娟;;生长调节剂和基质对紫花苜蓿扦插繁殖效率的影响[J];草业科学;2013年06期

4 马旭俊;刘春娟;吕世博;张超;;绿色荧光蛋白基因在水稻遗传转化中的应用[J];江苏农业科学;2013年04期

5 那光宇;张姝媛;郭娜;郭金丽;;什锦丁香花芽分化过程中植物内源激素的变化[J];内蒙古农业大学学报(自然科学版);2012年Z1期

6 许来俊;王成章;严学兵;张森浩;李佳;;苜蓿植株再生体系研究进展[J];草业科学;2012年08期

7 安惠惠;马晖玲;李坚;白生军;马祥;;农杆菌介导的Lyz-GFP基因对匍匐翦股颖Penn A-1转化和表达的研究[J];草业学报;2012年02期

8 郭英超;杜克久;贾哲;;兴安圆柏扦插生根过程中相关内源激素特征分析[J];中国农学通报;2012年01期

9 张博;兰再平;马可;胡海姿;;不同激素处理和基质配方对楸树嫩枝扦插生根的影响[J];林业科学研究;2011年06期

10 张立全;牛一丁;郝金凤;哈斯阿古拉;;通过花粉管通道法导入红树总DNA获得耐盐紫花苜蓿T_0代植株及其RAPD验证[J];草业学报;2011年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 潘竟丽;新疆盐生植物灰绿藜NHX1基因转化新疆大叶苜蓿植株再生及分子检测的研究[D];新疆农业大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 史毅;荧光标记的溶菌酶基因（Lyz-GFP）对苜蓿不同品种转化和表达的研究[D];甘肃农业大学;2013年

2 薛晓锋;紫花苜蓿再生体系及遗传转化的研究[D];河南科技学院;2012年

3 韩斌;溶菌酶-绿色荧光蛋白（Lyz-GFP）双元基因对苜蓿转化的研究[D];甘肃农业大学;2010年

4 柴燕文;PBI121-Lyz-GFP基因表达载体的构建及其对紫花苜蓿愈伤组织的转化[D];甘肃农业大学;2008年

5 葛军;紫花苜蓿组织培养再生体系的研究[D];北京林业大学;2004年

6 杨梅周;农杆菌介导酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因转化紫花苜蓿的研究[D];甘肃农业大学;2003年

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本文编号：630303