辣椒水通道蛋白基因家族分析及CaTIP1

发布时间：2016-07-04 08:07

  本文关键词：辣椒水通道蛋白基因家族分析及CaTIP1-1和CaPIP1-1功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

《西北农林科技大学》 2014年

辣椒水通道蛋白基因家族分析及CaTIP1-1和CaPIP1-1功能研究

尹延旭  

【摘要】：辣椒（Capsicum annuum L.）在亚热带和温带广泛栽培，是重要的风味蔬菜。目前，联合国粮农组织数据显示辣椒的需求在不断地增加。然而，辣椒在各地栽培中普遍受到生物和非生物胁迫的危害而减产，目前人们通过育种和栽培措施来提高辣椒对胁迫的抗性。但是，辣椒转基因工作开展以来，由于受到辣椒再生效率差、转化效率低和抗性基因挖掘不足的影响，进展缓慢。因此候选抗性资源和生物技术辅助育种成为我们研究的重点。实验室前期通过差异显示文库筛选到液泡膜水通道蛋白基因CaTIP1-1（tonoplastintrinsic protein gene1-1in pepper），本研究利用超量表达技术分析其在低温、渗透胁迫中的功能及作用机理。结合辣椒疫霉菌侵染处理转录数据库、外源脱落酸处理后辣椒低温胁迫消减杂交文库和韩国抗寒表达序列标签数据库，候选到辣椒质膜内在水通道蛋白基因CaPIP1-1（plasma membrane intrinsic protein gene1-1in pepper），利用病毒诱导基因沉默技术分析其在渗透胁迫中的功能。2014年辣椒栽培种遵辣和野生种CM334测序完成、公布，候选抗逆基因变得更加现实。本试验利用生物信息学知识对辣椒水通道蛋白全基因组特征进行分析，为辣椒水通道蛋白基因家族研究奠定基础。同时，为研究水通道蛋白基因在辣椒中的功能，本试验优化了辣椒再生体系。主要研究结果如下： 1.以膜内在蛋白的种子序列PF00230为基础，利用HMMER3.0软件在辣椒蛋白数据库中检索，CM334中检索到61条候选序列（V1.55），检索到的候选序列在染色体上能够定位的是56个水通道蛋白基因（aquaporins，AQPs）。这些AQPs在各染色体分布由多到少顺序为Chr01（11）、Chr06（9）、Chr03（6）、Chr11（6）、Chr02（5）、Chr08（5）、Chr10（5）、Chr04（3）、Chr09（2）、Chr12（2）、Chr05（1）、Chr07（1）。基因结构分析表明，这些水通道蛋白具有0（CaPIP2-7、CaTIP1-11、CaTIP1-12、CaTIP1-13、CaTIP1-16和CaSIP2-1）到4个内含子（CaNIP1-1、CaNIP3-1、CaNIP3-2、CaNIP4-2和CaNIP6-1）不等，内含子剪切模式为（GT/AG）或（CT/AC），在同一基因内，剪切方式一致。进化树构建结果表明辣椒AQPs细分为5类：液泡膜蛋白亚家族（TIPs，23）、质膜内在蛋白亚家族（PIPs，15）、类根瘤菌26蛋白（NIPs，10）、小碱基内在蛋白（SIP，3）和未知内在蛋白（XIPs，2）。通过结构预测，有41个辣椒水通道蛋白具有两个完整的天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)保守基序（或者类似NPA基序）。 2.对根、茎、叶和果实发育、成熟过程中24个组织水通道蛋白基因RNA-seq数据进行分析，有27个水通道蛋白基因（21个在分类中，其他6个在V1.5版本中）参与果实的发育和成熟过程。这些基因表达如下：辣椒水通道蛋白CaSIP1-2、 CaTIP1-1在辣椒CM334和ECW30R各组织中表达量都比较高。CaPIP2-9在辣椒CM334和ECW30R果实转色期后期（转色10d，CMPLB10，ECPLB10）的胎座中表达量相对降低，在CM334果实转色期后期（转色10d）的果皮中（CMPCB10）表达量也相对降低，在其他组织中表达量都比较高。表达丰度低或者基本不表达的基因有CaNIP7-1、CaNIP4-1、CaNIP3-1、CaNIP1-3、CaNIP4-3、CaNIP3-2、CaPIP1-5、CaTIP1-13、CaTIP1-10、 CA04g3870和CA00g98340，其他基因受果实发育或成熟诱导表达。基因CaNIP4-1、CaNIP7-1、CaNIP6-1、CaTIP3-1、CA10g07870、CA00g57100和CaTIP1-1（ECW30R中上调）在授粉后不同天数的辣椒果皮和胎座中上调表达。基因CaSIP1-2，CaPIP1-4、CaNIP4-2、CaPIP2-5、CaPIP2-8、CaPIP2-9、CaTIP1-1、CaTIP3-2、CaNIP5-1和CA08g13100在授粉后不同天数的辣椒果皮和胎座中下调表达。果实转色后上调基因为CaNIP1-1、CaNIP3-1、CaTIP3-1和CA00g98340，果实转色后下调基因为CaNIP1-3、CaNIP6-1、CaTIP1-1、CaPIP2-8和CaPIP2-9。 3.辣椒水通道蛋白CaTIP1-1有1个内含子，大小为1664bp，，内含子剪切方式是GT/AG，定位于液泡。该基因在花、果、种子中表达高于根、茎、叶。该基因受50μM升汞、低温和100μM氟啶酮下调表达，而受0.15M NaCl、0.15M甘露醇、5mM水杨酸和100μM脱落酸上调表达。病毒诱导该基因沉默后，植株表现矮化。 4.超量表达CaTIP1-1后，转基因烟草受连续低温胁迫后，恢复缓慢。转基因烟草气孔开张度明显大于非转基因烟草，大约86.3%的转基因烟草气孔宽长比处于0.31±0.047。非转基因烟草的光合速率在低夜温处理3d后抑制率达到45.29%，转入恢复阶段，非转基因材料恢复光合能力很快，大概1d后，其光合速率就达到或超过正常水平。转基因烟草在该处理后恢复较慢，胞间CO2浓度（Ci）高、光合速率较低。超量表达CaTIP1-1后，增强了细胞的活力、增加了活性氧清除相关酶活性和基因表达、提高了转基因烟草对盐胁迫和甘露醇胁迫的抗性。 5.辣椒质膜内在蛋白CaPIP1-1定位在质膜和其他亚细胞器，与番茄、马铃薯同一亚家族基因都含有3个内含子。该基因内含子剪切方式为CT/AC。该基因在果实中表达量最高，受升汞和氟啶酮抑制，受低温、盐、甘露醇、脱落酸和辣椒疫霉菌侵染上调表达。病毒诱导该基因沉默后，辣椒植株矮化，离体叶圆片对盐和甘露醇胁迫的抗性降低。 6.培养基GM3适合作为辣椒无菌苗生长的培养基。辣椒芽分化中，DM3和DM8适合B12芽分化、DM2适合HW203B芽分化、DM2和DM3适合CK7芽分化。在芽分化14-21d后，及时分离芽到伸长培养基上，能够提高辣椒芽的伸长率。

【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S641.3
【目录】：

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