胡杨Vps37基因家族进化分析及功能分化

发布时间：2017-08-11 19:12

  本文关键词：胡杨Vps37基因家族进化分析及功能分化

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【摘要】：基因家族为生物进化提供了最基本的遗传物质基础,基因家族不同拷贝的功能分化,是生物适应性进化的主要驱动力之一。Vps37是真核生物中特有的ESCRT复合物(胞内转运分选复合体)的重要组成蛋白,不仅参与了植物重要的生长发育过程,在植物盐胁迫等抗逆过程中起重要的作用。胡杨是重要的荒漠树种,具有很强的耐盐、耐旱、抗风沙等能力,是研究树木抗逆机理的主要模式树种之一。本研究中,通过系统发育分析方法研究胡杨Vps37基因家族的进化,以及通过植物转基因方法检测不同拷贝间可能存在的功能分化,得到如下结果:1)根据功能domain区与基序motif的分布及分子克隆技术的验证,证实胡杨Vps37基因家族有两个拷贝:PeVps37-1与PeVps37-2。氨基酸序列分析表明,胡杨两个基因均有一个Vps37基因家族特有的保守的Mod-r domain。进化分析发现,PeVps37-2具有较快的进化速率,受到了强烈正选择(dN/dS1),表明两个旁系同源基因间很可能发生了功能分化,胡杨PeVps37-2可能经历了潜在的适应性进化,这很可能对胡杨响应胁迫环境起关键作用。2)胡杨PeVps37-1与PeVps37-2在盐胁迫下,其表达模式发生了显著的分化。PeVps37-1与PeVps37-2主要在根、木质部、韧皮部中表达,在叶片中表达量较少,PeVps37-2在根、木质部中的表达量明显高于PeVps37-1。然而,当不同NaCl胁迫后,叶片组织中,PeVps37-1与PeVps37-2的表达量均显著升高;但在其他组织中却无明显的变化。亚细胞定位发现PeVps37-1与PeVps37-2均定位在细胞膜与细胞间质中。推测Vps37亚基协助ESCRT-Ⅰ复合物结合于质膜上,进而招募下游ESCRT-Ⅱ复合体,共同诱导内体膜生成初始芽体,进而在细胞间质中完成ESCRT复合体系统进行多囊泡体MVBs途径的功能。3)PeVps37-2转基因拟南芥在NaCl胁迫下长势和萌发率均优于Col-0与PeVps37-1转基因拟南芥,且在拟南芥致死浓度即200mMNaCl胁迫下仍然萌发率超过75%。在NaCl胁迫下观察根长发现PeVps37-2转基因拟南芥根长明显长于Col-0和PeVps37-1转基因拟南芥。说明超表达PeVps37-2提高了拟南芥抗盐能力。4)为了进一步研究PeVps37的生物学功能,PeVps37-1遗传转化入木本植物毛白杨中用溃疡病致病菌侵染高表达转基因毛白杨叶片,4~7天后可观察到毛白杨叶片接种菌斑的部位感病情况。发现转基因毛白杨叶片菌斑是野生型毛白杨的4~5倍,转基因毛白杨更加的感病。综上所述,胡杨Vps37基因家族两个成员PeVps37-1与PeVps37-2发生了明显的功能分化,PeVps37-2经历了适应性进化,其超表达有助于植物提高对盐胁迫的抗性。
【关键词】：胡杨 基因家族 Vps37 进化分析 抗盐性 功能分化
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S792.11
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-21
• 1.1 基因家族10-14
• 1.1.1 基因家族的形成10-11
• 1.1.2 基因家族的进化11-13
• 1.1.3 基因家族功能分化对物种分化的意义13-14
• 1.2 空泡蛋白分选（Vps）基因家族14-17
• 1.2.1 空泡蛋白分选家族14
• 1.2.2 ESCRT复合物系统的研究进展14-17
• 1.3 胡杨的基本特性及研究意义17-19
• 1.3.1 胡杨的基本特性17-18
• 1.3.2 杨树的生物与非生物胁迫18-19
• 1.3.3 杨树基因工程19
• 1.4 本研究的主要目的及意义19-21
• 第二章 材料与方法21-42
• 2.1 材料21-24
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 菌种与质粒21
• 2.1.3 菌种与质粒21-22
• 2.1.4 抗生素与激素的配制22
• 2.1.5 培养基的配制22-23
• 2.1.6 质粒提取自配试剂23
• 2.1.7 CTAB法提取RNA试剂23-24
• 2.1.8 其它试剂24
• 2.2 实验方法24-42
• 2.2.1 进化分析24-25
• 2.2.2 引物设计25-26
• 2.2.3 植物表达载体的构建26-36
• 2.2.4 毛白杨的遗传转化36-37
• 2.2.5 转基因杨树的鉴定37-38
• 2.2.6 拟南芥的遗传转化38-39
• 2.2.7 转基因拟南芥的筛选39
• 2.2.8 亚细胞定位39-40
• 2.2.9 盐处理胡杨扦插幼苗40
• 2.2.10 荧光定量40-41
• 2.2.11 盐处理转基因拟南芥41-42
• 第三章 结果分析42-54
• 3.1 PeVps37基因家族的生物信息学分析42-45
• 3.1.1 转录组数据分析42
• 3.1.2 PeVps37基因家族的序列比对42-43
• 3.1.3 PeVps37基因结构分析43
• 3.1.4 预测PeVps37的蛋白三级结构43-44
• 3.1.5 系统发育分析及选择压力检测44-45
• 3.1.6 通过PAML软件计算选择45
• 3.2 PeVps37基因家族的功能验证45-54
• 3.2.1 盐处理下胡杨Vps37基因家族的时空表达分析45-46
• 3.2.2 亚细胞定位46-47
• 3.2.3 遗传转化拟南芥47-48
• 3.2.4 35S::PeVps37-1 与 35S::PeVps37-2 转基因拟南芥NaCl胁迫实验48-50
• 3.2.5 NaCl胁迫下根长的测定50
• 3.2.6 遗传转化毛白杨及转基因植株的获得50-52
• 3.2.7 溃疡病侵染转基因毛白杨52-54
• 第四章 讨论54-57
• 4.1 植物Vps37基因家族进化历史54
• 4.2 胡杨Vps37基因家族的适应性进化54-55
• 4.3 胡杨Vps37基因功能分化55-57
• 4.3.1 盐胁迫下胡杨Vps37基因家族的时空表达分析55
• 4.3.2 亚细胞定位55
• 4.3.3 超表达转PeVps37基因拟南芥55
• 4.3.4 超表达转PeVps37基因毛白杨感病分析55-57
• 第五章 结论与展望57-58
• 5.1 主要结论57
• 5.2 展望57-58
• 参考文献58-66
• 在学期间的研究成果66-67
• 致谢67

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本文编号：657804