SLC7A5基因在肿瘤细胞中的表达调控研究

发布时间：2017-08-11 23:06

  本文关键词：SLC7A5基因在肿瘤细胞中的表达调控研究

  更多相关文章： SLC7A5 促癌作用 细胞增殖 TGF-β p53

【摘要】：氨基酸是构成蛋白质的基本元件,同时参与细胞内许多重要的代谢途径,氨基酸的转运异常会导致严重的氨基酸吸收和代谢障碍性疾病,因此氨基酸的转运具有重要的病理学意义。在哺乳动物中,氨基酸的跨膜运输是由多种氨基酸转运载体蛋白所介导,原因在于氨基酸属于小分子极性物质,不能自由通过细胞膜,必须由细胞膜上相应的氨基酸转运蛋白协助。在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭过程中同样也需要大量的氨基酸提供营养,而氨基酸转运蛋白为肿瘤细胞氨基酸的进出提供了载体通道,所以氨基酸转运蛋白在肿瘤发生及进展中具有关键性作用,其调控机制研究一直是肿瘤领域的热点问题。L型氨基酸转运载体1(L-type amino acid transporter 1,LAT1),又称为SLC7A5,为L型氨基酸转运载体中的重要成员,主要负责转运大的、支链的、芳香族的中性氨基酸,包括一些必需氨基酸。已有文献表明,SLC7A5在一些肿瘤组织(如胶质瘤)中异常高表达,但是对其具体的生物学功能则研究较少,鉴于SLC7A5的研究将对今后医学、营养学等生命科学研究具有重要意义,故本文就该氨基酸转运载体蛋白的表达、调节及其相关研究作进一步的探讨。本课题主要由三部分组成：1:SLC7A5基因的GEO数据库组织表达谱分析我们利用NCBI-GEO数据库分析了SLC7A5基因在小鼠和人源的不同正常组织中的表达丰度。发现该基因在小鼠和人的大脑、睾丸、卵巢、胎盘等正常组织中高表达,而在肺、心、肝脏等组织中表达量较少,结果显示SLC7A5基因在这两个物种中的表达具有组织特异性,同时又具有物种之间表达的相似性。利用该数据库我们还分析了SLC7A5在人不同肿瘤组织中的表达情况,结果表明,与正常组织相比,SLC7A5基因在肿瘤组织中普遍高表达,提示其可能发挥促癌作用。2:SLC7A5基因在肿瘤细胞中的生物学效应分析以人源非小细胞肺癌细胞系H1299和人源乳腺癌细胞系MCF-7为研究材料,通过RT-PCR实验,初步明确了SLC7A5基因在这两个细胞系中的表达水平。成功构建了含SLC7A5基因ORF区域的重组质粒pcDNA3.1-SLC7A5,在上述两个细胞系中转染该质粒,通过MTT及流式细胞实验检测了SLC7A5基因对细胞增殖能力和细胞周期的影响。结果显示SLC7A5可以促进H1299细胞和MCF-7细胞的增殖,且大部分细胞处于DNA复制的S期,。以上结果说明SLC7A5基因在肿瘤细胞中发挥促进细胞增殖的作用。最后,通过在H1299和MCF-7细胞中过表达pcDNA3.1-SLC7A5,结合RT-PCR实验,从分子层面探讨了SLC7A5基因对细胞周期相关基因的调控。结果表明,在H1299细胞中,SLC7A5可以促进cyclinA1、cyclinE1的表达,而对其他基因的表达无显著影响；在MCF-7细胞中,SLC7A5可以促进cyclinD1、cyclinE1的表达,对其他基因的表达无显著影响。3:SLC7A5基因在肿瘤细胞中的转录调控分析利用生物信息学软件分析SLC7A5的启动子区域,发现该区域有一个转录起始位点(TSS),以及多个转录因子结合区域,其中包括smad、p53的结合位点,提示SLC7A5可能与TGF-β/Smads信号通路或p53的调控相关。我们构建了含SLC7A5启动子区域的质粒pGL3-SLC7A5 promoter,将它同Renilla质粒共转染到H1299、MCF-7细胞中,通过双荧光素酶报告基因实验验证SLC7A5基因在这两个细胞中的转录水平。结果发现,SLC7A5在H1299细胞中的启动子活性高于MCF-7细胞。由于MCF-7细胞中含有野生型p53基因,而H1299为p53缺失型细胞,我们推测p53会对SLC7A5基因起调控作用。由此,我们进一步探讨了野生型p53及突变型p53对SLC7A5基因的调控作用。在H1299和MCF-7细胞中分别转染pcDNA3.1-mut p53(H175)、pcDNA3.1-mut p53(W248)、pcDNA3.1-wt p53、pcDNA3.1质粒,通过RT-PCR实验,证实了突变型p53可以促进SLC7A5的表达,而野生型p53可以在一定程度上抑制SLC7A5的表达。此外,将外源TGF-β1、TGF-β3分别作用于H1299和MCF-7细胞,通过RT-PCR实验,证实了在H1299细胞中,SLC7A5的表达水平随着TGF-β1、TGF-β3浓度的增高而增高；对于MCF-7细胞,在5ng/ml的TGF-β1、TGF-β3浓度下,SLC7A5的表达水平最高,但在10ng/ml的条件下,SLC7A5的表达量有所下降。结果表明SLC7A5可以响应TGF-β1/3的刺激,但其表达水平因细胞类型的不同而有所不同。综上,本论文明确了SLC7A5基因在肿瘤中发挥促癌作用；确定了SLC7A5基因可以通过上调细胞周期相关基因的表达,从而促进细胞的增殖；TGF-β1/3和p53参与调控SLC7A5基因的表达,具体体现在TGF-β1/3在一定程度上促进SLC7A5基因的表达,而野生型p53抑制SLC7A5,突变型p53可以促进SLC7A5的表达。
【关键词】：SLC7A5 促癌作用 细胞增殖 TGF-β p53
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 主要缩略词表13-14
• 第一章 绪论14-23
• 1.1 肿瘤概况14-15
• 1.2 氨基酸转运蛋白与肿瘤发生15-17
• 1.2.1 氨基酸转运蛋白简介15-16
• 1.2.2 氨基酸转运蛋白SLC7A5与肿瘤发生16-17
• 1.3 细胞周期蛋白与肿瘤发生17
• 1.4 转录因子p53与肿瘤发生17-20
• 1.5 TGF-β/Smads信号通路与肿瘤发生20-21
• 1.6 论文研究思路21-23
• 第二章 SLC7A5基因的GEO组织表达谱分析23-26
• 2.1 前言23
• 2.2 方法23
• 2.2.1 实验方法23
• 2.3 结果与讨论23-25
• 2.3.1 SLC7A5在小鼠正常组织中的GEO组织表达谱分析24
• 2.3.2 SLC7A5在人正常组织和相应的肿瘤组织中的GEO组织表达谱分析24-25
• 2.4 本章小结25-26
• 第三章 SLC7A5基因在肿瘤细胞中的生物学效应分析26-42
• 3.1 前言26
• 3.2 材料与方法26-36
• 3.2.1 仪器26
• 3.2.2 材料26-27
• 3.2.3 实验方法27-36
• 3.3 结果与讨论36-40
• 3.3.1 分析SLC7A5在H1299和MCF-7细胞系中的表达情况36
• 3.3.2 SLC7A5基因重组表达质粒的构建36-37
• 3.3.3 SLC7A5对H1299和MCF-7细胞增殖的影响37-38
• 3.3.4 SLC7A5对H1299和MCF-7细胞周期的影响38-39
• 3.3.5 SLC7A5对细胞周期相关基因表达的影响39-40
• 3.4 本章小结40-42
• 第四章 SLC7A5在肿瘤细胞中的转录调控分析42-58
• 4.1 前言42
• 4.2 材料与方法42-49
• 4.2.1 仪器42-43
• 4.2.2 材料43-44
• 4.2.3 实验方法44-49
• 4.3 结果与讨论49-56
• 4.3.1 生物信息学方法分析SLC7A5的启动子区域49
• 4.3.2 SLC7A5启动子在肿瘤细胞中的转录活性分析49-51
• 4.3.3 不同的p53基因对肿瘤细胞中SLC7A5表达调控的影响51-54
• 4.3.4 TGF-β1/3对肿瘤细胞中SLC7A5表达调控的影响54-56
• 4.4 本章小结56-58
• 结论58-59
• 参考文献59-66
• 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文66-67
• 致谢67

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本文编号：658619