家蚕微孢子虫Met-AP2基因验证与烟曲霉素治疗效果检测

发布时间：2017-08-14 19:35

  本文关键词：家蚕微孢子虫Met-AP2基因验证与烟曲霉素治疗效果检测

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【摘要】：微孢子虫可以感染几乎所有动物,包括大多数的昆虫,微孢子虫和微孢子虫病的研究一直是病理学领域的研究热点。家蚕微孢子虫病既可以通过水平传播,也可以经胚胎传播,威胁着各养蚕国家的蚕桑产业的健康可持续发展,因此家蚕微孢子虫病是蚕业生产上最重要的检疫防控对象。自从在人肠道微孢子虫病治疗研究中发现烟曲霉素及其衍生物、类似物均具有明显的治疗效果,且作用的靶位点是Met-AP2基因,这为家蚕微孢子虫病的治疗机理研究提供了方向。故本课题拟在家蚕微孢子虫基因组和转录组数据库中筛选寻找家蚕微孢子虫Met-AP2基因的存在基础上,尝试应用对人微孢子虫病治疗有效的药物烟曲霉素对家蚕微孢子虫病进行模拟治疗研究,探讨药物处理前后在人工感染家蚕微孢子虫的家蚕组织中微孢子虫Met-AP2基因的变化规律,以期为家蚕微孢子虫病的治疗提供实验参考和理论依据。本论文在课题组前期开展家蚕微孢子虫基因组和转录组(广东株)研究基础上,通过生物信息学方法筛选出与烟曲霉素药物治疗相关靶基因Met-AP2进行了PCR测序验证及检测应用研究,并对其基因功能及其在家蚕组织中的不同侵染阶段的表达功能等进行了分析研究,旨在为家蚕微孢子虫病有效治疗提供分子依据。结果如下:(1)家蚕微孢子虫Met-AP2基因的验证及生物信息学分析在对家蚕微孢子虫的转录组数据中推断的Met-AP2基因进行PCR克隆测序验证,经不同引物测序验证发现相似性都在93%以上,其中MC-F/R引物测序结果与转录组数据相似性高达99.9%;以引物MC-F/R,2047F/R对其他家蚕常见病原微生物及4种昆虫微孢子虫中Met-AP2基因的特异性,敏感性进行PCR鉴别,并以引物MC-F/R对相应片段进行克隆测序分析。发现家蚕微孢子虫(广东株)只存在一个Met-AP2基因,开放阅读框1077 bp,共编码358个氨基酸,其编码蛋白的分子量约为45kDa,为疏水的稳定蛋白。Met-AP2基因序列上没有预测的信号肽糖基化位点及跨膜结构域,其蛋白结构中存在典型的α helix元件。(2)建立了原核重组质粒pET-28a met使用pET-28a载体,Rosetta感受态细胞,对Met-AP2进行原核表达,并通过SDS-PAGE和Western blot验证其分子量为45KDa,与预测结果相符。对融合蛋白进行镍琼脂糖亲和层析纯化后得到纯度较高的蛋白。(3)家蚕微孢子虫烟曲霉素治疗效果验证及Met-AP2靶基因应用对正常家蚕、感病家蚕、只添食药物烟曲霉素家蚕和感病后烟曲霉素治疗的家蚕进行了比较观察,发现添食药物之后的家蚕表面无明显的病斑。同时筛选了5对以Met-AP2基因为靶基因的LAMP引物,选了其中一个效果较好的引物LM1,优化了合适的内外引物配比和扩增温度,创新地建立一套基于Met-AP2基因的家蚕微孢子虫LAMP检测方法。同时通过对添食药物前后不同时期中肠组织的进行了LAMP检测,从分子水平上验证了烟曲霉素治疗家蚕微孢子虫病的效果,为生产上推进应用烟曲霉素药物治疗家蚕微孢子虫病提供实验参考。
【关键词】：家蚕微孢子虫 Met-AP2基因 基因验证 烟曲霉素 LAMP 治疗效果
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S884
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 论文缩写词中英文对照7-11
• 1.前言11-28
• 1.1 微孢子虫概述11-15
• 1.1.1 微孢子虫结构11-12
• 1.1.2 微孢子虫基因组学研究进展12-15
• 1.2 家蚕微孢子虫病的发病及流行15-16
• 1.2.1 家蚕微孢子虫发病及症状15-16
• 1.2.2 家蚕微孢子虫病的流行16
• 1.3 微孢子虫病的诊断16-18
• 1.3.1 微孢子虫病病原染色鉴别16-17
• 1.3.2 微孢子虫病的免疫学方法诊断17
• 1.3.3 微孢子虫病的分子生物学方法诊断17
• 1.3.4 微孢子虫病的LAMP方法诊断17-18
• 1.4 微孢子虫的治疗18-21
• 1.4.1 微孢子虫的物理治疗18-19
• 1.4.2 微孢子虫的化学治疗19-21
• 1.5 烟曲霉素21-22
• 1.5.1 烟曲霉素的发现及结构21
• 1.5.2 烟曲霉素的用途及治疗作用进展21-22
• 1.6 Met-AP2基因的研究概述22-25
• 1.6.1 Met-AP的发现22
• 1.6.2 Met-AP的简介22-23
• 1.6.3 Met-AP2的结构特点23-24
• 1.6.4 Met-AP2的功能及进展24-25
• 1.7 烟曲霉素抑制Met-AP2的作用机理25-26
• 1.8 本论文研究意义及内容26-28
• 2. 材料与方法28-44
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 生物材料28-29
• 2.1.2 主要试剂及药品29-30
• 2.1.3 主要仪器30
• 2.1.4 软件及相关在线预测网站30-31
• 2.2 方法31-44
• 2.2.1 生物材料的分离、纯化、核酸提取31-33
• 2.2.2 家蚕微孢子虫Met-AP2基因注释和功能预测33-34
• 2.2.3 家蚕微孢子虫Met-AP2基因引物的设计34
• 2.2.4 不同昆虫微孢子虫Met-AP2基因的PCR扩增34-35
• 2.2.5 微孢子虫Met-AP2基因克隆重组质粒的构建及测序分析35-36
• 2.2.6 家蚕微孢子虫Met-AP2基因系统发育分析36
• 2.2.7 家蚕微孢子虫Met-AP2基因原核表达36-40
• 2.2.8 家蚕微孢子虫Met-AP2基因LAMP方法建立40-44
• 3 结果与分析44-78
• 3.1 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗结果44-48
• 3.1.1 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗表征观察结果44-46
• 3.1.2 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗治愈率及对家蚕影响的结果46-48
• 3.2 家蚕微孢子虫（广东株）转录组的Met-AP2基因测序结果的PCR验证48-57
• 3.2.1 家蚕微孢子虫Met-AP2基因引物筛选验证48-55
• 3.2.2 家蚕微孢子虫（广东株）转录组的Met-AP2基因测序结果验证55-56
• 3.2.3 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗前后PCR扩增结果56-57
• 3.3 家蚕微孢子虫Met-AP2基因的生物信息学及分析57-63
• 3.3.1 家蚕微孢子虫Met-AP2蛋白的结构分析57-59
• 3.3.2 家蚕微孢子虫Met-AP2基因与其他物种Met-AP2基因相似性及进化树分析59-63
• 3.4 家蚕微孢子虫Met-AP2蛋白的原核表达63-68
• 3.4.1 大肠杆菌克隆载体的构建和鉴定63-64
• 3.4.2 大肠杆菌重组表达载体pET-28A met的构建和鉴定64-65
• 3.4.3 融合蛋白诱导结果65-66
• 3.4.4 融合蛋白的镍琼脂糖亲和层析纯化66-67
• 3.4.5 融合蛋白的鉴定及浓度测定67-68
• 3.5 基于Met-AP2靶基因的LAMP方法在烟曲霉素治疗效果检测上的应用68-78
• 3.5.1 基于Met-AP2靶基因的LAMP引物的筛选结果68-70
• 3.5.2 基于Met-AP2靶基因的LM1引物组反应条件的优化70-72
• 3.5.3 基于Met-AP2靶基因的LM1引物组的特异性及灵敏度检测72-77
• 3.5.4 基于Met-AP2靶基因的LM1引物组的烟曲霉素治疗效果的检测77-78
• 4 讨论与结论78-86
• 4.1 讨论78-85
• 4.1.1 家蚕微孢子虫病的症状及烟曲霉素治疗情况研究78-79
• 4.1.2 家蚕微孢子虫Met-AP2基因研究79-83
• 4.1.3 家蚕微孢子虫Met-AP2蛋白研究83-84
• 4.1.4 家蚕微孢子虫病治疗效果LAMP检测研究84-85
• 4.1.5 后续工作85
• 4.2 结论85-86
• 致谢86-87
• 参考文献87-99
• 附录A99-107
• 附录B107-109
• 攻读学位期间的学术成果109

【参考文献】

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本文编号：674380