热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

发布时间：2017-08-16 20:26

  本文关键词：热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

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【摘要】：【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌(Thermodesulfovibrio yellowstonii H.)Pif1解旋酶(TyPif1),研究TyPif1解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将Typif1解旋酶编码区和SUMO促溶标签编码区融合连入pET15b获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化获得融合蛋白,SUMO蛋白酶切除标签,再经Ni-NTA柱去除标签蛋白及SUMO蛋白酶,经Heparin柱进一步纯化最终获得TyPif1全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱(CD)和荧光共振能量转移(FRET)分析TyPif1解旋酶的DNA结合活性、解旋活性以及二级结构的热稳定性。【结果】获得了纯度大于95%的TyPif1蛋白,1L培养基可以获得约10mg纯度大于95%的蛋白;TyPif1解旋酶结合单链DNA和G4DNA的活性明显高于双链DNA;TyPif1具有较高的解旋G4DNA的活性,在25~60℃下其二级结构相对稳定,且解旋速率随温度升高而增大,25~50℃TyPif1的解旋速率由0.09s-1增大到0.23s-1。【结论】表达纯化了热脱硫弧菌TyPif1解旋酶,其不仅具有良好的热稳定性,同时具有特异的结合和解旋G4DNA的能力。
【作者单位】： 西北农林科技大学生命科学学院;
【关键词】： 热脱硫弧菌 Pif解旋酶 蛋白表达纯化 DNA结合活性 DNA解旋活性
【基金】：国家自然科学基金项目(31370798,11304252)
【分类号】：Q936
【正文快照】： 解旋酶是一类利用水解NTP释放的能量沿着DNA磷酸骨架移动的分子“马达”,参与核酸复制、转录、重组与修复等过程,在生物体内扮演着重要的角色[1-2]。其相关基因突变会导致遗传病的发生,如Werner综合症、Bloom综合症等[3-4]。Pif1解旋酶是高度保守的5′→3′方向解旋酶,属于解

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