转ZmHAK1基因拟南芥吸收转运钾离子的研究及RNA干扰载体的构建

发布时间：2017-08-16 22:12

  本文关键词：转ZmHAK1基因拟南芥吸收转运钾离子的研究及RNA干扰载体的构建

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【摘要】：钾是农作物生产、丰收必不可少的营养元素,但我国耕地土壤普遍缺钾,钾素缺乏已成为作物优质高产的限制因子。植物在逆境胁迫下生长,有许多非生物胁迫应答基因参与调控,使植物自身适应环境。随着基因工程技术的不断发展,许多低钾胁迫应答基因被发现。研究这些耐低钾基因的功能,培育出新的耐低钾农作物品种,将其应用到农业生产中,是高效利用土壤中钾素营养的有效途径。低钾胁迫下,植物主要利用高亲和钾转运体吸收介质中的K+,因此研究高亲和钾转运体吸收转运钾的能力具有实践意义。为此,本文进行了转Zm HAK1基因拟南芥的研究及RNAi表达载体的构建,旨在探索Zm HAK1基因对植物吸收转运钾离子能力的影响。本试验利用蘸花侵染法将已构建的p Cambia1301-Zm HAK1重组质粒转化到高亲和钾转运体基因缺失的拟南芥突变体中。利用浓度为0.1%的Basta对转化植株进行筛选,对存活的阳性植株进行Bar基因和Zm HAK1基因的PCR检测,检测结果表明成功获得了转Zm HAK1基因的T1代拟南芥植株。继续繁殖、筛选、鉴定获得能够稳定遗传的转基因拟南芥T5代。以T5代植株为材料进行q RT-PCR试验。结果表明,Zm HAK1基因在转基因拟南芥植株各组织均有表达,无表达特异性,但在根、茎中表达量较高。对转基因拟南芥在持续低钾胁迫处理下根、茎、花中Zm HAK1基因表达水平进行分析,结果表明Zm HAK1基因的表达受低钾胁迫诱导,不同组织中目的基因表达量不同程度上调,且维持较高表达水平,其中根部目的基因表达量上调最高,72h时的表达量达到处理前的19倍。钾吸收动力学试验结果表明,过表达转基因拟南芥具有较大的Imax值和较小的Km、Cmin、β值,并且在较短的时间内达到吸收平衡,说明过表达拟南芥植株有较强的吸钾能力。钾含量相关指标分析结果表明,过表达拟南芥有较大的AKA和KUI值,说明过表达植株不仅有较强的吸钾能力,而且有较好利用钾的能力。主要逆境生理指标分析测定结果表明,过表达拟南芥植株在低钾胁迫环境中,细胞受伤害程度明显低于突变体对照,进一步说明过表达拟南芥植株耐低钾胁迫能力较突变体对照有所提高,能够对低钾胁迫产生响应。低钾胁迫下过表达转基因拟南芥植株和突变体植株的根长、开花时间及成熟期性状比较结果表明,过表达植株开花早于突变体;籽粒千粒重高于突变体;在一定范围内,钾含量越低根越显著长于突变体,说明过表达植株对低钾有更好的适应性。本试验构建了RNA干扰表达载体p RNAi-Zm HAK1,为进行玉米遗传转化奠定基础,期望利用RNAi技术干扰玉米中Zm HAK1基因的表达,来进一步探究该基因的功能。
【关键词】：转基因拟南芥 ZmHAK1基因 表达分析 钾效率 RNA干扰载体
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文缩写词表12-13
• 第1章 文献综述13-23
• 1.1 钾资源状况13-15
• 1.1.1 土壤供钾状况13-14
• 1.1.2 钾肥资源状况14-15
• 1.2 植物钾营养性状改良15-21
• 1.2.1 植物钾效率的遗传基础15-16
• 1.2.2 植物钾效率的分子基础16-19
• 1.2.3 植物钾营养性状的改良19
• 1.2.4 植物遗传转化方法概述19-21
• 1.3 RNA干扰技术21
• 1.4 研究目的与意义21-23
• 第2章 ZmHAK1转化拟南芥突变体23-31
• 2.1 材料与方法23-27
• 2.1.1 试验材料与试剂23-24
• 2.1.2 植物材料的培养及处理24
• 2.1.3 pCambia1301- ZmHAK1转化菌种的验证24-25
• 2.1.4 蘸花侵染法转化拟南芥突变体25-26
• 2.1.5 转基因拟南芥的筛选26
• 2.1.6 转基因拟南芥DNA的PCR验证26-27
• 2.2 结果与分析27-30
• 2.2.1 pCambia1301-ZmHAK1转化菌种的验证27
• 2.2.2 阳性转化子的筛选27-28
• 2.2.3 T1代阳性转化子DNA的PCR鉴定28-29
• 2.2.4 转基因拟南芥的稳定性检测29-30
• 2.3 讨论30-31
• 第3章 ZmHAK1在转基因拟南芥中的表达分析31-39
• 3.1 材料与方法31-34
• 3.1.1 植物材料及处理31
• 3.1.2 转基因拟南芥总RNA提取31-32
• 3.1.3 反转录合成cDNA32-33
• 3.1.4 qRT-PCR定量分析33-34
• 3.2 结果与分析34-37
• 3.2.1 转基因拟南芥提取的总RNA34
• 3.2.2 ZmHAK1基因在转基因拟南芥中组织特异性表达分析34-35
• 3.2.3 ZmHAK1基因低钾胁迫诱导表达分析35-37
• 3.3 讨论37-39
• 第4章 转ZmHAK1基因拟南芥钾效率探索39-53
• 4.1 材料与方法39-45
• 4.1.1 植物材料39
• 4.1.2 钾吸收动力学研究39-40
• 4.1.3 钾含量测定40-41
• 4.1.4 生理指标测定41-45
• 4.2 结果与分析45-51
• 4.2.1 钾吸收动力学特性分析45-47
• 4.2.2 钾利用机制研究47-51
• 4.3 讨论51-53
• 第5章 转ZmHAK1基因拟南芥表型分析53-57
• 5.1 材料与方法53-54
• 5.1.1 材料处理53-54
• 5.1.2 试验方法54
• 5.2 结果与分析54-56
• 5.2.1 拟南芥花期54-55
• 5.2.2 根伸长量55
• 5.2.3 成熟期性状55-56
• 5.3 讨论56-57
• 第6章 pRNAi- ZmHAK1表达载体的构建57-71
• 6.1 材料与方法57-65
• 6.1.1 试验材料57-58
• 6.1.2 正、反向片段的获得58-63
• 6.1.3 正向片段插入中间载体pSK-int63-64
• 6.1.4 反向片段插入重组质粒pSK-int-ZmZ64
• 6.1.5 RNAi表达载体的构建64-65
• 6.2 结果与分析65-69
• 6.2.1 重组质粒T-ZmGRZ、T-ZmGRF的验证65-66
• 6.2.2 正向片段插入到中间载体pSK-int66-67
• 6.2.3 反向片段插入到重组质粒pSK-int-ZmZ67-68
• 6.2.4 反向重复序列插入到表达载体68-69
• 6.3 讨论69-71
• 研究结论71-72
• 参考文献72-80
• 作者简介80-81
• 致谢81

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