大黄鱼清道夫受体家族基因鉴定及表达分析

发布时间：2017-08-18 00:17

  本文关键词：大黄鱼清道夫受体家族基因鉴定及表达分析

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【摘要】：清道夫受体(Scavenger receptors,SRs)是由一类结构各异功能多样的跨膜表面糖蛋白分子组成的蛋白质家族,本文主要基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组数据库,对大黄鱼清道夫受体家族成员进行密码子偏好性、系统演化等生物信息学分析;对克隆得到全家族成员的完整编码区的重要结构域进行解析;再利用致病性溶藻弧菌进行腹腔刺激感染,分析不同家族成员的mRNA表达模式,选取表达明显上调的A和F家族基因成员进行重点分析和后续研究,具体包括以下几方面:1.针对大黄鱼清道夫受体4个家族8个成员的密码子偏好性进行分析,全部成员均包含20种不同的氨基酸。通过Codon W等偏好性软件计算包括密码子适应指数在内的11个偏好性指数,比较综合地反应了清道夫受体家族在进化中的密码子偏好情况,进一步与人清道夫受体家族成员进行对比,结果并未显示大黄鱼清道夫受体家族有强的密码子偏好使用情况;基于RSCU值绘制59个同义密码子的偏好热图,也未显示出该家族基因密码子有强的偏好程度,对应性分析结果表明所有四种核苷酸结尾的密码子在Axis1-Axis2的四个象限都有分布,其中第一和第四象限分布较少,第二和第三象限分布较为集中,但未发现较强的线性关系,综合上述结果认为在大黄鱼清道夫受体家族基因密码子中没有偏好使用情况。2.在了解大黄鱼清道夫受体家族基因密码子偏好性的基础上,进一步阐释了整个清道夫家族基因的系统演化规律。根据已获得的清道夫受体家族基因序列,经BLASTn同源性分析显示,大黄鱼清道夫4个家族8个成员均可以找到与之同源的不同物种的相应分子序列,所有序列均证实与全基因组测序后的注释一致,基因名称也并未出现差异。利用进化树分析软件MEGA v4.0构建无根系统发育树,4个家族8个基因分别与不同物种的同一家族基因相互成簇,各聚成支,例如A和F家族的成员,D家族单独成支。每一个家族随物种进化程度不同而相互分开,说明各受体基因家族存在明显差别,具有相对独立的保守结构域,进化的变异程度不同。从基因线性结构来看,8个成员分布在8个不同的Scaffold位置,意味着这些基因或许处于不同的染色体,所有清道夫家族成员基因的方向不完全一致,可能与基因的转录效率和基因表达强度,及与之相关的调控过程有关。根据大黄鱼全基因组数据库,分析清道夫受体外显子与内含子结构,结果显示各成员所拥有不同数目和不同长度的外显子和内含子,可能与基因在转录进化过程有关。进一步预测7个成员基因(除LycSCARB1以外)的蛋白质三维结构,比较其关键功能域的空间位置,上述研究结果对解析清道夫受体的基因起源、分型聚类、结构组成以及染色体上的基因线性组成,为后续功能研究奠定基础。3.对大黄鱼清道夫受体基因的表达调控模式进行研究,来进一步掌握清道夫受体家族的免疫功能。组织特异性表达研究显示,大黄鱼所有清道夫受体基因在肝脏、脾脏、脑、心脏、头肾、肌肉、腮和肠等组织中的都有表达,其中肝脏、脾脏、脑、头肾、肌肉5种组织中表达量较高,心脏、腮和肠等3种组织中表达量较低。a家族基因在脾脏中的表达量最高,而其他家族基因都在肝脏中有最高的表达水平。所有基因都对溶藻弧菌感染后表现出上调表达,但最高表达量出现的时间略有差别,基本都集中在24~48小时之间,f家族中的lycsrec2从感染后6h就开始表现出高的表达量。另一方面,细胞质膜、细胞外部和溶酶体是清道夫受体的主要亚细胞定位区,即a家族和f家族基因主要集中在细胞质膜上,b家族的lyccd163主要集中在细胞外部,lycscarb1和d家族主要集中溶酶体上。结合上述实验结果发现,a家族和f家族对藻弧菌感染有较强的应激反应,但具体的调控机制还需要进一步研究。4.对其中具有免疫功能的a家族成员进行深入研究,通过基因同源克隆得到lycscara3、lycscara5和lycmarco三个基因开放阅读框,经序列比对和系统进化分析发现所得到的三个基因与已知的scara3,scara5和marco基因高度同源。lycscara3和lycscara5在进化树中分别与其他硬骨鱼类的相关基因聚成一支,而lycmarco却与爬行动物聚成一支,说明三个基因在进化上存在一定的差异。clustalw分析显示lycscara3与其他物种的scara3的同源性为59~71%,lycscara5为55~72%,而lycmarco只有38%左右。在lycscara5羧基末端发现6个半胱氨酸富集区(c-482,c-495,c-526,c-536,c-546和c-556,在lycmarco羧基末端同样发现6个半胱氨酸富集区(c-333,c-346,c-374,c-384,c-394和c-404)。在lycscara3和lycscara5中还发现了两处与traf2结合的结构域和涉及内在折叠的酪氨酸保守区。利用genemaperv2.5对三个基因的dna序列进行分析,lycscara3和lycmarco的外显子都为13个,内含子12个,lycscara5则短一些只有12个外显子和11个内含子。对a家族成员在8种组织中的差异性表达分析表明,lycscara3、lycscara5和lycmarco三个基因均在脾脏出现最高表达,在肌肉,脑和肝脏中都有较高表达。进一步通过溶藻弧菌感染,检测脾脏中三个基因的时序变化情况,结果显示溶藻弧菌可上调三个基因的表达,但最高表达量出现的时间略有差别,相对于lycscara3,由于srcr结构域的存在,lycscara5和lycmarco基因对感染较为敏感且反应较为迅速。通过原核表达得到LycMARCO基因蛋白的初级产物,可以为今后的蛋白功能研究以及信号通路研究提供参考。5.同源法克隆得到LycSREC1和LycSREC2两个基因开放阅读框,经序列比对和系统进化分析发现所得到的三个基因与已知的SREC I和SREC II基因高度同源。LycSREC1分子包含有8个EGF或EGF-like结构域,而LycSREC2分子包含有7个EGF或EGF-like结构域,从氨基酸比较分析来看,LycSREC1和LycSREC2基因与其他物种的相应分子存在一些保守的区域,尤其是在一些重要的结构域上,如EGF结构域、TRAF2因子和酪氨酸活化区等特殊因子或结构域等。针对LycSREC1和LycSREC2两个基因中出现的EGF结构域进行物种差异性比对发现,EGF结构域在这些物种中相对保守,仅有几个位点的氨基酸存在变异,说明EGF结构域在长期进化中相对保守的,并未出现大量的变异位点,这可能与其所行使的功能有关。LycSREC1的DNA序列共长7603 bp,拥有12个外显子和11个内含子,而LycSREC2的DNA序列仅长4883bp,仅有4个外显子和3个内含子,都短于人和鼠等哺乳类动物。将大黄鱼清道夫受体F家族成员及与其关联基因和人相关基因进行比较发现有部分基因发生了偏移,其中有5个基因在10个不同物种中也同样出现了基因偏移现象,这将有助于理解基因的漂变和物种适应性变化。进一步通过溶藻弧菌感染,检测肝脏中LycSREC1和LycSREC2基因mRNA的时序表达变化发现两个基因都对溶藻弧菌刺激表现出上调表达,但最高表达量出现的时间略有差别,LycSREC2较LycSREC1早一点,在感染后6小时就达到峰值,表达值是对照组的40倍左右,而LycSREC1在感染后12小时才达到峰值,仅是对照组的15倍左右。上述结果充分说明,大黄鱼清道夫受体家族基因成员参与了鱼类的天然免疫,通过密码子偏好性、系统演化等阐释了清道夫受体在免疫过程中的基本分子机制,对A和F家族的系统研究将有助于理解清道夫受体在石首鱼类天然免疫受体家族中的作用,为今后开展鱼病防治和疫苗研究提供借鉴,但仍有一些侵染机制目前尚无从知晓,有待后续研究。
【关键词】：大黄鱼 溶藻弧菌 清道夫受体家族 免疫调控 表达
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4;Q78
【目录】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-18
• 第一章 文献综述18-27
• 1.1 大黄鱼常见病原微生物18-19
• 1.2 鱼类主要免疫器官与免疫细胞19
• 1.3 先天性免疫模式识别受体19-23
• 1.3.1 可溶性桥接型模式识别受体20-21
• 1.3.2 内吞型模式识别受体21-22
• 1.3.3 信号传导型模式识别受体22-23
• 1.3.4 以巨噬细胞为主的先天免疫系统23
• 1.4 清道夫受体家族的发展历程及分类23-24
• 1.4.1 清道夫受体家族的发现23-24
• 1.4.2 家族成员分类24
• 1.5 清道夫受体家族的免疫特性24-25
• 1.6 本文所做工作及研究内容25-27
• 第二章 大黄鱼清道夫受体家族密码子偏好性分析27-39
• 2.1 材料与方法27-30
• 2.1.1 基因组来源27
• 2.1.2 相关软件及计算公式27-30
• 2.2 结果与讨论30-37
• 2.2.1 常规参数30-31
• 2.2.2 偏好性指数31-35
• 2.2.3 基于RSCU值的偏好性分析35-36
• 2.2.4 对应性分析36-37
• 2.3 本章小结37-39
• 第三章 大黄鱼清道夫受体家族系统演化分析39-52
• 3.1 材料与方法39-44
• 3.1.1 主要仪器39-40
• 3.1.2 实验材料预处理40
• 3.1.3 总RNA抽提与cDNA第一链合成40-41
• 3.1.4 大黄鱼清道夫受体家族基因扩增与纯化41-43
• 3.1.5 T-A克隆与测序43-44
• 3.1.6 序列分析44
• 3.2 结果与讨论44-51
• 3.2.1 重测序验证44
• 3.2.2 同源性分析44-46
• 3.2.3 系统进化发育分析46-48
• 3.2.4 基因线性结构分析48-49
• 3.2.5 外显子与内含子结构分析49-50
• 3.2.6 蛋白质三维结构分析50-51
• 3.3 本章小结51-52
• 第四章 大黄鱼清道夫受体家族的表达调控分析52-61
• 4.1 材料与方法52-54
• 4.1.1 实验动物处理与样品收集52
• 4.1.2 总RNA抽提与cDNA第一链合成52
• 4.1.3 组织特异性分布表达52-53
• 4.1.4 受溶藻弧菌感染后的基因时空表达53
• 4.1.5 数据分析53-54
• 4.1.6 亚细胞定位预测54
• 4.2 结果与讨论54-60
• 4.2.1 8 种组织的总RNA特征54
• 4.2.2 清道夫受体的组织特异性分布54-56
• 4.2.3 受溶藻弧菌感染后清道夫受体的时空表达56-57
• 4.2.4 亚细胞结构定位57-60
• 4.3 本章小结60-61
• 第五章 大黄鱼清道夫受体A家族鉴定和表达分析61-79
• 5.1 材料与方法61-65
• 5.1.1 样品收集与总RNA抽提61
• 5.1.2 cDNA第一链合成与基因克隆61
• 5.1.3 序列分析61-62
• 5.1.4 受溶藻弧菌感染后清道夫受体A家族基因的表达模式62
• 5.1.5 清道夫A家族MARCO基因胞内段克隆62-63
• 5.1.6 双酶切与原核表达重组载体构建63-64
• 5.1.7 诱导表达与SDS-PAGE电泳分析64-65
• 5.2 结果与讨论65-77
• 5.2.1 大黄鱼清道夫受体A家族基因序列分析65-68
• 5.2.2 氨基酸比对分析68-71
• 5.2.3 主要结构域分析71
• 5.2.4 系统进化分析71-72
• 5.2.5 基因结构分析72-74
• 5.2.6 mRNA表达分析74
• 5.2.7 原核表达分析74-76
• 5.2.8 讨论76-77
• 5.3 本章小结77-79
• 第六章 大黄鱼清道夫受体F家族的鉴定和表达分析79-94
• 6.1 材料与方法79-80
• 6.1.1 样品收集与总RNA抽提79
• 6.1.2 cDNA第一链合成与基因克隆79
• 6.1.3 序列分析79-80
• 6.1.4 受溶藻弧菌感染后清道夫受体F家族基因的表达模式80
• 6.2 结果与讨论80-92
• 6.2.1 大黄鱼清道夫受体F家族基因序列分析80-82
• 6.2.2 氨基酸比对分析82-84
• 6.2.3 主要结构域分析84-86
• 6.2.4 系统进化分析86-87
• 6.2.5 基因结构分析87-88
• 6.2.6 基因线性结构分析88-90
• 6.2.7 mRNA表达分析90-91
• 6.2.8 讨论91-92
• 6.3 本章小结92-94
• 参考文献94-105
• 致谢105-106
• 在读期间发表的学术论文及研究成果106-107

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