猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因序列分析

发布时间：2017-08-18 20:10

  本文关键词：猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因序列分析

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【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种急性传染病,可引起猪只急性腹泻并迅速脱水、死亡,对哺乳仔猪危害最大。近年来,PED在世界各地频繁爆发。众多研究表明,PEDV变异是导致疫情加剧的主要原因。因此对变异毒株开展组织培养特性、病理学特性、分子生物学特性的系统研究具有重要意义。本研究以采自四川峨眉某猪场疑似PEDV感染仔猪的小肠及内容物作病料,经RT-PCR检测,选择PEDV阳性病料按常规方法处理后接种Vero细胞进行病毒分离,并在细胞维持液中按5 μg/mL量加入胰酶,盲传至出现典型细胞病变。结果在第5代开始出现细胞病变(CPE),传至第25代可在接毒后20 h稳定出现典型CPE,表现为细胞变圆和变亮、颗粒物变多、细胞融合、细胞脱落、死亡并形成拉网状,对分离毒进行挑斑纯化。经RT-PCR检测和S基因测序证实本研究成功分离了PEDV毒株,将其命名为EM-P株。经测定病毒的TCID50为1×10-6·5/mL将分离株EM-P口服接种1周龄哺乳仔猪,成功建立PED病理模型。相应组织器官病理组织学观察显示,PEDV EM-P株所致感染呈持续性、多脏器性,且主要损伤肠道、肠系膜淋巴结、肺、脾。剖检病理变化表现为肠壁变薄、充血,肠上皮细胞脱落；肠系膜淋巴充血,淋巴细胞减少、细胞空泡变性：肺边缘贫血,局部淤血、水肿,肺泡融合：脾边缘变薄呈半透明状,白髓萎缩等。利用PEDV N基因和内参基因GAPDH基因建立了qRT-PCR方法,并用该方法对相应组织进行病毒载量检测,结果在肠、肠系膜淋巴结、肺、脾中病毒载量最高,而且感染时间早、持续时间长。以上研究结果表明感染仔猪病理损伤程度与病毒载量呈正相关。参照Genebank已公布的PEDV CV777株全基因序列,设计18对引物,对EM-P株进行全基因分段克隆。EM-P株接种Vero细胞至75%以上细胞出现CPE后,提取总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到18个片段,经克隆、测序及拼接,获得EM-P株全基因组(cDNA)序列。基因组全长28029 bp,经与已报道6个代表毒株进行比对分析,结果显示EM-P株具有典型的PEDV基因组特征,与参考毒株同源性在97.3%-98.2%。以PEDV CV777株为参考对各基因序列进行分析,结果显示EM-P株S1基因、ORF1基因等出现明显变异,推测其可能导致毒株免疫原性和病毒复制能力等生物特性改变。而EM-P株ORF3基因具有完整的开放阅读框,符合强毒株特征。以PEDV CV777株等18个毒株为参考,重点对EM-P株S基因序列进行系统分析并构建遗传进化树,显示EM-P株位于G1-1亚群,但又独立为一个分支,说明EM-P株可归为新流行毒株；EM-P株与CV777株、加拿大、日本、韩国等其它多数国家的流行毒株及2010年以前的中国毒株处于同一亚群,提示该毒株既可能由国外传入也可能是原有流行毒株变异而成。
【关键词】：猪流行性腹泻病毒 分离 鉴定 全基因测序
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词8-11
• 第一章 文献综述11-18
• 1 PEDV病原学特性11
• 2 PEDV基因组结构特征11-13
• 2.1 5'-UTR与3'-UTR11-12
• 2.2 结构基因12
• 2.3 非结构基因12-13
• 2.4 基因分型和流行特点13
• 3 PEDV细胞培养特性13-15
• 4 PEDV致病性15-17
• 4.1 流行病学15-16
• 4.2 临床症状16
• 4.3 解剖症状16
• 4.4 发病机理16-17
• 5 PEDV检测方法17
• 6 研究目的和意义17-18
• 第二章 PEDV EM-P株的分离与鉴定18-37
• 1 实验材料18-20
• 1.1 病料收集18
• 1.2 主要试剂及配制18-19
• 1.3 仪器设备19
• 1.4 引物合成19
• 1.5 细胞及实验动物19-20
• 2 实验方法20-23
• 2.1 病料处理及RT-PCR检测20
• 2.2 PEDV的分离与培养20-21
• 2.3 RT-PCR检测及S基因测序21
• 2.4 病毒TCID_(50)的测定21
• 2.5 分离株人工感染哺乳仔猪试验21-23
• 3 结果23-32
• 3.1 RT-PCR检测结果23-24
• 3.2 PEDV的分离与培养24-25
• 3.3 RT-PCR检测及S基因测序25-26
• 3.4 病毒TCID_(50)测定26
• 3.5 分离株人工感染哺乳仔猪试验26-32
• 4 讨论32-36
• 4.1 分离株的Vero细胞培养特性33
• 4.2 分离株的病理学特性33-36
• 5 小结36-37
• 第三章 PEDV EM-P株全基因测序37-57
• 1 试验材料37-39
• 1.1 毒株、细胞及主要试剂37
• 1.2 主要仪器设备37
• 1.3 分子生物学分析软件37
• 1.4 引物设计与合成37-39
• 2 试验方法39-43
• 2.1 PEDV的增殖39
• 2.2 RNA提取39
• 2.3 cDNA合成39-40
• 2.4 扩增与克隆40-41
• 2.5 目的片段纯化41
• 2.6 重组质粒构建41-42
• 2.7 全基因组序列分析42-43
• 3 结果43-52
• 3.1 全基因分段扩增及克隆43-44
• 3.2 全基因组序列拼接44-45
• 3.3 全基因组分析45-46
• 3.4 各序列片段遗传与变异情况46-51
• 3.5 针对S基因的进化树构建51-52
• 4 讨论52-55
• 4.1 全基因序列分析52
• 4.2 各序列片段遗传与变异情况52-55
• 4.3 系统发育关系分析55
• 5 小结55-57
• 全文总结57-58
• 参考文献58-64
• 致谢64-65
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文65

【参考文献】

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本文编号：696504