玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

发布时间：2017-08-18 21:26

  本文关键词：玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

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【摘要】：【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ(COXⅢ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达。【方法】在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COXⅢ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、Prot Param和Target P 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COXⅢ基因分别与载体p EASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、p ET32a、pET42a连接,构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、p ET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(WB)对表达结果进行验证。【结果】获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1 Da,理论等电点p I 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白。系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近。原核表达结果表明,该蛋白在18℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个分子量约为62 k D的融合蛋白。【结论】成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据。
【作者单位】： 西北农林科技大学无公害农药研究服务中心;陕西省生物农药工程技术研究中心;
【关键词】： 玉米象 细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ RACE技术 生物信息学 原核表达
【基金】：国家自然科学基金(31101457) 西北农林科技大学基本科研业务费专项资金(2452015014)
【分类号】：S379.5
【正文快照】： 0引言【研究意义】玉米象(Sitophilus zeamais)是一种世界性的储粮害虫[1],也是较难防治的仓储害虫之一[2]。目前防治玉米象主要使用化学合成熏蒸剂,如溴甲烷、硫酰氟以及磷化铝等。2015年,溴甲烷在全球范围内已被禁用,磷化氢也因长期使用引起严重的抗药性问题[3-4],因此寻找

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本文编号：696880