油棕脂肪酸脱饱和酶基因启动子的克隆和调控机制分析

发布时间：2017-08-19 06:08

  本文关键词：油棕脂肪酸脱饱和酶基因启动子的克隆和调控机制分析

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【摘要】：油棕(Elaeis guineensis Jacq.)是热带地区最为重要的油料作物之一,因其果实含油量高以及单位面积产油量大而被誉称为“世界油王”。棕桐油在脂肪酸种类和含量方面表现出与油菜、大豆等大宗油料作物不同的特性,其中不饱和脂肪酸(油酸和亚油酸)比例约占总脂肪酸的50%。目前,国内外尚未见有关油棕不饱和脂肪酸的分子调控机制研究报道。本研究分别克隆和鉴定了油棕中三个不同脂肪酸脱饱和酶基因(ω3、△6、△12)的启动子序列,别对其调控机制展开研究,取得了以下研究结果：以油棕叶片基因组DNA为模板,在油棕基因组序列的基础上合成了的油棕脱饱和酶基因ω3、Δ6、Δ12的启动子的特异性引物,利用PCR技术扩增及TA克隆的方法分别得到了长度为1144 bp、1474 bp、1233bp的油棕脱饱和酶基因ω3、△6、△12脂肪酸脱饱和酶基因启动子序列。通过PlantCARE软件分析该序列的顺式作用元件,发现这三个启动子都含有植物基因启动子所特有的CAAT-box和TATA box结构域；同时,克隆的启动子序列中还包含有大量相关的光反应元件和一些激素响应元件：如脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯响应元件等。通过构建含gus的植物表达载体,并通过农杆菌介导转化转基因拟南芥。对转基因拟南芥进行gus组织染色及gus活性表达分析。结果表明：克隆获得的ω3、Δ6、Δ12启动子序列和下游gus基因已经稳定的整合到获得的转基因拟南芥基因组当中；同时,gus基因在拟南芥不同组织中体现出明显的组织特异性,其中,ω3启动子在拟南芥茎及叶片处具有组织特异性,在茎处表达量最高,在叶片的叶脉处表达次之：△6启动子在叶片和果荚处具有组织特异性,叶片处的表达量高于果荚处。△12启动只在叶片处具有组织特异性。为了研究外界因素对不饱和脂肪酸基因表达的调控机制,对含有ω3、Δ6、Δ12启动子转基因拟南芥进行不同光周期、低温、脱落酸、乙烯、水杨酸和茉莉酸甲酯的处理。处理后GUS活性定量分析表明：ω3启动子在光周期处理的条件下,叶片和茎的GUS活性增加；在脱落酸处理后,叶片和茎的GUS活性增加；在茉莉酸的处理下,叶片中的GUS蛋白活性下降,而茎中的GUS蛋白活性却上升；在4。C低温处理的情况下,叶片和茎的GUS蛋白活性呈现出先升高,再下降；水杨酸的处理下,叶片及茎的GUS活性增加；乙烯利的处理下,叶片的GUS蛋白活性呈增加的趋势,茎的GUS蛋白活性呈下降的趋势。△6启动子在光周期处理的条件下,叶片及果荚的部为的GUS活性增加；在脱落酸的处理下,叶片处及果荚处的GUS蛋白活性明显增加；在4℃低温处理的情况下,叶片和果荚的GUS蛋白活性增加；在茉莉酸的处理下,叶片和果荚中的GUS活性均下降。△12启动子在光周期照处理的条件下,叶片处的GUS蛋白活性先降低后升高；脱落酸处理下,叶片处的GUS蛋白活性先降低后升高；在茉莉酸的处理下,叶片的GUS蛋白活性下降；4℃低温处理的情况下,叶片的GUS蛋白活性呈下降趋势;水杨酸下的处理,叶片GUS活性明显增加。综上可得出,这三个启动子的表达受到光周期、低温、脱落酸、乙烯、水杨酸和茉莉酸甲酯这些激素调控作用。
【关键词】：油棕 ω3、△6、△12 启动子 组织特异性 gus基因
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.9;Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 前言10-17
• 1.1 油棕介绍10
• 1.2 油棕果实中油脂代谢的研究进展10-11
• 1.2.1 油棕果实中油脂含量的种类及其动态变化10-11
• 1.2.2 油棕果实中油脂代谢的研究进展11
• 1.3 植物脂肪酸脱饱和酶基因的研究进展11-12
• 1.4 植物组织特异性启动子的概况12-13
• 1.4.1 植物组织特异性启动子的定义、特点及分类12-13
• 1.5 植物组织特异性启动子的研究进展13-14
• 1.5.1 根特异性启动子13
• 1.5.2 叶片特异性启动子13
• 1.5.3 花特异性启动子13-14
• 1.5.4 种子特异性启动子14
• 1.5.5 其他特异性启动子14
• 1.6 研究的目的和意义14-16
• 1.7 本研究的技术路线16-17
• 2 材料与方法17-29
• 2.1 实验材料17-18
• 2.1.1 植物材料17
• 2.1.2 菌株17
• 2.1.3 试剂17
• 2.1.4 培养基17-18
• 2.1.5 仪器18
• 2.2 实验方法18-29
• 2.2.1 油棕脱饱和酶基因(ω3、Δ6、Δ12启动子的克隆18-22
• 2.2.2 启动子生物信息学分析22
• 2.2.3 植物表达载体的构建22-24
• 2.2.4 根癌农杆菌转化法侵染拟南芥24-25
• 2.2.5 拟南芥抗性苗的筛选25-26
• 2.2.6 转基因拟南芥植株的鉴定26
• 2.2.7 转基因拟南芥植株的表达分析26-27
• 2.2.8 启动子的功能验证27-29
• 3 结果与分析29-59
• 3.1 ω3、Δ6、Δ12启动子的克隆29-30
• 3.1.1 PCR产物的检测29
• 3.1.2 TA克隆菌落PCR的验证29-30
• 3.2 ω3、Δ6、Δ12启动子序列的生物信息学分析30-36
• 3.3 ω3、Δ6、Δ12启动子的植物表达载体的构建及农杆菌转化36-39
• 3.3.1 ω3、Δ6、△12启动子的植物表达载体的构建36-38
• 3.3.2 启动子转农杆菌的鉴定38-39
• 3.4 拟南芥抗性苗的筛选及转基因拟南芥的鉴定39-42
• 3.4.1 拟南芥抗性苗的筛选39-40
• 3.4.2 转基因拟南芥的鉴定40-42
• 3.5 转基因拟南芥的表达分析42-47
• 3.5.1 转基因拟南芥的GUS组织染色分析42-45
• 3.5.2 启动子在转基因拟南芥的GUS活性定量分析45
• 3.5.3 启动子在拟南芥不同器官中的GUS活性定量分析45-47
• 3.6 启动子的功能验证47-59
• 3.6.1 光周期处理47-50
• 3.6.2 脱落酸(ABA)的处理50-52
• 3.6.3 茉莉酸甲酯反应(MeJA)的处理52-54
• 3.6.4 低温的处理54-56
• 3.6.5 乙烯利对ω3启动子的处理56-57
• 3.6.6 水杨酸(SA)对ω3、Δ12启动子的处理57-59
• 4 讨论59-64
• 4.1 脱饱和酶基因启动子的克隆及生物信息学分析59-60
• 4.2 植物表达载体的构建及GUS组织化学分析60
• 4.3 启动子GUS活性定量分析60-61
• 4.4 启动子的功能验证61-64
• 5 结论64-66
• 参考文献66-74
• 附录74-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 颜彦;林拥军;;一个水稻鞘叶特异表达启动子的克隆及功能鉴定[J];农业生物技术学报;2013年07期

2 周文化;郑仕宏;蒋爱民;;植物油脂脂肪酸组成及位置分布研究进展[J];粮食与油脂;2011年03期

3 李志邈;杨悦俭;杨飞;叶青静;王荣青;阮美颖;周国治;姚祝平;;番茄根特异表达基因LeGRP2启动子的克隆及其在拟南芥的表达分析[J];中国农业科学;2010年09期

4 郝迪，

本文编号：699077