池蝶蚌性别相关基因Transformer-2α的分子特征及在不同组织和不同发育阶段的表达分析

发布时间：2017-08-20 18:15

  本文关键词：池蝶蚌性别相关基因Transformer-2α的分子特征及在不同组织和不同发育阶段的表达分析

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【摘要】：池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)是日本独特品种,产自日本滋贺县的琵琶湖,其育珠能力及抗病能力均优于其他淡水珍珠蚌。本课题以池蝶蚌为实验对象,取材于4龄健康成熟个体性腺组织,通过SMART RACE PCR及巢式PCR技术克隆获得性别相关基因Transformer-2α(以下简称:Hs-Tra2α)的ORF(Open reading frame)框序列及上下游非编码区序列,运用生物信息学方法对其结构特征进行了分析。Hs-Tra2α基因cDNA全长1051bp,其中5’UTR(Untranslated Region)长75bp,3’UTR长139bp,包括加尾信号:AATAAA保守区序列及下游丰富的poly(A)序列;ORF框序列长837bp,编码由278个氨基酸组成的亲水蛋白质,理论等电点为PI=11.42,分子质量约为32715.88Da,经在线预测,Hs-Tra2α蛋白细胞亚定位于细胞核。结构域检测分析表明:Hs-Tra2α蛋白质含有SR蛋白(serine/arginine-rich splicing factor,SRSF)家族的高度保守的精氨酸(R)和丝氨酸(A)二肽富集结构域(RS Domain)和RNA识别基元(RNA recognition motif,RRM),也叫RNA结合结构域(RNA binding domain,RBD),RRM结构域下游含有Tra2家族特异性Linker连接区序列。利用predictprotein在线预测其蛋白二级结构显示Hs-Tra2α蛋白含有大量的无规则卷曲,在RRM结构域区域呈现α螺旋和β折叠交替排列;采用SWISS-MODEL在线预测了Hs-Tra2α蛋白的三维结构模型与二级结构预测结果一致,在RRM结构域可见α螺旋和β折叠交错排列,可明显看到β1α1β2β3α2β4结构存在;根据氨基酸与其他物种的同源性,利用Mega4.0软中邻位连接法构建了Hs-Tra2α氨基酸序列的系统进化树,结果显示Hs-Tra2α在进化树上与太平洋牡蛎Tra2α并为一支,在进化地位上相当保守。采用实时荧光定量技术对Hs-Tra2α基因在4龄成熟池蝶蚌精巢、卵巢、外套膜、心脏、闭壳肌、肝胰腺、肠、肾、血淋巴、斧足、鳃共11个组织中的mRNA表达进行了检测分析,结果显示:Hs-Tra2α基因普遍地在各个组织中获得表达,不同组织间存在明显的差异性,在精巢和卵巢中表达量最高,表达量分别为血淋巴中的53.67倍和23.47倍,表明Hs-Tra2α基因在池蝶蚌不同组织中具有多种生理功能。由于其在性腺中的高表达,我们重点对Hs-Tra2α基因在精巢和卵巢1~5龄不同发育阶段的表达进行了检测分析,结果显示Hs-Tra2α基因在精巢和卵巢的不同发育阶段均得到表达,且存在明显的差异性,Hs-Tra2在1~5龄精巢和卵巢中的表达量随着性腺的形成、增殖、生长及成熟呈现规律性变化,Hs-Tra2α在1龄和2龄阶段性腺形成和增殖期有一定量的表达,在2龄和3龄阶段性腺生长、成熟期表达量显著增加,其中在卵巢3龄阶段表达量最高,达1龄阶段的10.66倍,在精巢2龄和3龄阶段的表达量最高,达1龄阶段的30倍,在4龄和5龄即池蝶蚌性成熟后的性腺周年性发育阶段有较低表达量,表明Hs-Tra2α基因参与调控池蝶蚌性腺的雌雄特异性性别分化,对性腺的增殖、发育及成熟有着至关重要的作用,在第一次性腺成熟后低表达以维持性腺周年性发育。
【关键词】：池蝶蚌 Tra2α 分子特征 生物信息学 荧光定量
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 本实验所需的器材及试剂7-11
• 第一章 综述11-21
• 1.1 基因型性别决定机制11-14
• 1.2 环境型性别决定机制14-16
• 1.3 贝类性别研究进展16-17
• 1.4 Transformer2基因的研究现状17-20
• 1.5 本研究的内容、目的及意义20-21
• 第二章 池蝶蚌Tra2α基因的cDNA全序列克隆及分析21-44
• 2.1 实验材料与方法22-28
• 2.1.1 实验材料22
• 2.1.2 池蝶蚌性腺总RNA的提取22
• 2.1.3 RNA的质量检测22-23
• 2.1.4 总RNA的DNase处理23
• 2.1.5 SMART cDNA的合成23-24
• 2.1.6 池蝶蚌Tra2α基因中间片段的获得24-25
• 2.1.7 RACE-PCR方法克隆池蝶蚌Tra2α基因cDNA全长25-26
• 2.1.8 PCR产物检测、目的片段的回收、挑克隆与测序26-28
• 2.1.9.池蝶蚌.Tra2α.基因全长序列拼接及开放阅读框序列分析28
• 2.2 生物信息学分析28-30
• 2.2.1 池蝶蚌Tra2α蛋白氨基酸组成分析28
• 2.2.2 池蝶蚌Tra2α蛋白结构域分析28-29
• 2.2.3 池蝶蚌Tra2α蛋白亲水性、信号肽及蛋白分布检测29
• 2.2.4 池蝶蚌Tra2α蛋白二级结构预测29-30
• 2.2.5 池蝶蚌Tra2α蛋白三级结构预测30
• 2.2.6 池蝶蚌Tra2α氨基酸同源性分析及系统进化树的构建30
• 2.3 结果30-42
• 2.3.1 总RNA的提取30-31
• 2.3.2 池蝶蚌.Tra2α.基因部分序列的获得31
• 2.3.3 池蝶蚌Tra2α基因cDNA全长序列获得31-32
• 2.3.4 池蝶蚌Tra2α基因全长核酸序列分析32-33
• 2.3.5 池蝶蚌Tra2α蛋白氨基酸组成分析33-35
• 2.3.6 池蝶蚌Tra2α蛋白结构域分析35
• 2.3.7 池蝶蚌Tra2α蛋白亲水性及信号肽检测35-37
• 2.3.8 池蝶蚌Tra2α蛋白二级结构预测37-39
• 2.3.9 池蝶蚌Tra2α蛋白三级结构预测39-40
• 2.3.10 池蝶蚌Tra2α氨基酸同源性分析及系统进化树的构建40-42
• 2.4 讨论42-44
• 第三章 池蝶蚌Tra2α基因在不同组织和不同发育阶段的表达分析44-56
• 3.1 实验材料与方法45-48
• 3.1.1 实验材料45
• 3.1.2 总RNA提取45
• 3.1.3 总RNA提取及质量检测45
• 3.1.4 荧光定量cDNA模板的合成45-46
• 3.1.5 荧光定量PCR引物设计46-47
• 3.1.6 池蝶蚌Tra2α基因在不同组织中的荧光定量检测47
• 3.1.7 池蝶蚌Tra2α基因在不同龄池蝶蚌性腺组织中的荧光定量检测47-48
• 3.2 实验结果48-52
• 3.2.1 池蝶蚌Tra2α基因的组织差异性表达分析48-50
• 3.2.2 池蝶蚌Tra2α基因在不同年龄池蝶蚌性腺中差异表达分析50-52
• 3.3 讨论52-56
• 第四章 结论与展望56-58
• 4.1 结论56-57
• 4.2 进一步的工作方向57-58
• 致谢58-59
• 参考文献59-65
• 攻读硕士期间的研究成果65

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