凡纳滨对虾的FREP和SRB-Croquemort基因在对虾免疫应答中的相关研究

发布时间：2017-08-23 19:47

  本文关键词：凡纳滨对虾的FREP和SRB-Croquemort基因在对虾免疫应答中的相关研究

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【摘要】：凡纳滨对虾(Litopeneaus vannamei,L.vannamei)又称南美白对虾,因其具有生长速度较快,成年个体的体积较大,繁殖期的持续时间较长、对蛋白质的需求量相对较低,但肉品质相对较高以及可在低盐度与高密度的水域中养殖等优点,迅速成为我国乃至全世界虾类养殖数量最高的虾类之一,然而,随着养殖规模的不断扩大,养殖对虾的病害问题也逐渐严重,其中危害最为严重的是病毒和细菌,因此,研究对虾的免疫防御机制,了解对虾的免疫基础,对于对虾的养殖具有重大的经济价值。本试验依据同源物种的基因序列设计引物,结合RACE技术克隆得到了凡纳滨对虾的两个纤维蛋白原相关蛋白基因(LvFREP1和LvFREP2)和一个B类清道夫受体Croquemort型基因(LvSRB-Croquemort)。通过生物信息学分析这几个基因的结构特点及其同源性,再利用半定量PCR(RT-PCR)检测在鳃、肝胰腺、血淋巴、心脏、肠、肌肉、神经组织等10个组织中的表达差异,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测在注射鳗弧菌(Vibrio anguillarum,V.anguillarum)、溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus,M.lysodeikticus)和白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后不同时间点凡纳滨对虾这三个基因的时空表达规律。此外,对LvSRB-Croquemort进行dsRNA干扰沉默后并注射哈维氏弧菌(Vibro harveyi,V.harveyi)检测不同时间点相关基因的表达规律,对这些基因做了初步的研究,得到了以下试验结果:(1)LvFREP1基因克隆得到的序列有三种,定义为LvFREP1-1、LvFREP1-2和LvFREP1-3。LvFREP1-1的基因长度为802bp,开放阅读框为783bp,编码260个氨基酸,LvFREP1-2的基因长度为1714bp,开放阅读框为1689bp,编码562个氨基酸;LvFREP1-3的基因长度为1593bp,开放阅读框为1569bp,编码522个氨基酸;LvFREP2基因序列长度为942bp,开放阅读框长939bp,编码312个氨基酸;LvSRB-Croquemort基因的编码区长度为1602bp,编码533个氨基酸。(2)系统发育分析结果显示:这三种基因都与对应基因的日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的同源性最高,与其他物种同源性都相对较低。(3)组织表达分布结果显示:LvFREP1基因只在鳃、血淋巴、肠、心脏和神经组织中被检测到,其中在鳃中表达量最高;LvFREP2基因在血淋巴和鳃中表达量较高,其他组织表达量较少或者不表达;LvSRB-Croquemort基因在所有检测到的组织中均有表达,在血淋巴和精巢中表达量最高。(4)病原刺激的时序表达结果显示:LvFREP1基因在鳗弧菌刺激组中,其表达量逐渐升高,在48h时有所下降,在溶壁微球菌组中,其表达量逐渐升高,并且随后差异达到显著和极显著,在白斑综合征病毒组中在24h有所上升;LvFREP2基因的鳗弧菌组中在6h时其表达量显著高于对照组,12h时表达量开始降低,溶壁微球菌和白斑病毒刺激组在6h和48h均有表达高峰期;LvSRB-Croquemort基因,在鳗弧菌组中,其表达量在注射6h后达到最大,之后逐渐降,在溶壁微球菌组中,其表达量在48h才有比较明显的上升;在白斑病毒组中,其表达量在先降低后上升。(5)用dsRNA干扰技术沉默LvSRB-Croquemort基因之后的结果显示:对虾的三种抗菌肽ALF,Crustin,Pen3的表达量在沉默该基因之后总体都有显著下降的趋势,而其两个转录因子中,Dorsal没有显著变化,Relish的表达量先降低后升高。以上结果表明:LvFREP1,LvFREP2,LvSRB-Croquemort基因都可能参与着对虾对抗病原体刺激的先天性免疫反应过程。
【关键词】：凡纳滨对虾 模式识别受体(PRRs) FREP1 FREP2 SRB-Croquemort
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1.1 凡纳滨对虾的生物学信息12-13
• 1.2 凡纳滨对虾养殖病害防治现状13-14
• 1.3 凡纳滨对虾免疫系统14-16
• 1.3.1 物理屏障14-15
• 1.3.2 体液免疫15
• 1.3.3 细胞免疫15-16
• 1.4 模式识别受体相关研究16-18
• 1.4.1 TLR16-17
• 1.4.2 CLR17
• 1.4.3 NLR17
• 1.4.4 RLR17-18
• 1.4.5 胞质DNA识别分子18
• 1.5 对虾免疫基因FREPS和SR-BS的研究进展18-22
• 1.5.1 FREPs基因的研究进展18-21
• 1.5.2 SR-Bs基因的研究进展21-22
• 1.6 研究的目的和意义22-24
• 第二章 凡纳滨对虾LvFREP1基因克隆及表达分析24-39
• 2.1 试验材料25-26
• 2.1.1 试验动物25
• 2.1.2 试验中所用的细菌和病毒25
• 2.1.3 主要试剂和试剂盒25
• 2.1.4 主要的仪器设备25-26
• 2.2 试验方法26-30
• 2.2.1 引物设计与合成26
• 2.2.2 总RNA提取26
• 2.2.3 cDNA的合成26-27
• 2.2.4 FREP1部分目的片段的扩增27
• 2.2.5 利用RACE技术获得目的基因的编码区27-28
• 2.2.6 FREP1基因的生物信息学分析28-29
• 2.2.7 FREP1基因在各组织表达分析29
• 2.2.8 FREP1基因在不同病原刺激后的时序表达29-30
• 2.3 结果与分析30-36
• 2.3.1 DNA产物扩增结果30
• 2.3.2 凡纳滨对虾FREP1基因生物信息分析30-35
• 2.3.3 FREP1基因在各组织内的表达观察35-36
• 2.3.4 FREP1基因对不同病原体刺激的时序表达36
• 2.4 讨论36-38
• 2.5 小结38-39
• 第三章 凡纳滨对虾LvFREP2基因克隆及表达分析39-50
• 3.1 试验材料40
• 3.2 试验方法40-42
• 3.2.1 总RNA提取及cDNA合成40
• 3.2.2 引物设计与合成40
• 3.2.3 基因片段克隆40-41
• 3.2.4 电泳检测41
• 3.2.5 目的片段回收41
• 3.2.6 连接转化41
• 3.2.7 阳性克隆筛选41-42
• 3.2.8 LvFREP2基因的生物信息学分析42
• 3.2.9 LvFREP2基因对不同病原体的时序表达42
• 3.2.10 LvFREP2基因在各组织的表达42
• 3.3 结果与分析42-48
• 3.3.1 凡纳滨对虾引物检测42-43
• 3.3.2 凡纳滨对虾目的片段回收43
• 3.3.3 克隆筛选结果43-44
• 3.3.4 LvFREP2基因序列分析44-45
• 3.3.5 系统进化分析45-47
• 3.3.6 LvFREP2基因对不同病原体刺激的时序表达47-48
• 3.3.7 LvFREP2基因在各组织中表达分析48
• 3.4 讨论48-49
• 3.5 小结49-50
• 第四章 凡纳滨对虾LvSR-B Croquemort基因在免疫应答中的相关研究50-62
• 4.1 试验材料51
• 4.1.1 试验动物51
• 4.1.2 试验中所用到病原51
• 4.1.3 试验仪器和试剂51
• 4.2 试验方法51-55
• 4.2.1 总RNA的提取及第一条cDNA的合成51
• 4.2.2 引物设计与合成51-52
• 4.2.3 SR-B Croquemort基因部分片段的扩增52-53
• 4.2.4 扩增产物的电泳检测、回收及连接转化53
• 4.2.5 通过RACE技术获得目的基因的编码区53
• 4.2.6 SR-B Croquemort基因的生物信息学分析53
• 4.2.7 SR-B Croquemort基因的组织表达53
• 4.2.8 SR-B Croquemort基因对不同病原体的时序表达53-54
• 4.2.9 SR-B Croquemort基因dsRNA的体外模板合成、转录纯化及沉默该基因后相关基因的表达变化54-55
• 4.3 结果与分析55-60
• 4.3.1 LvSRB Croquemort基因的编码区序列及其对应的核酸序列55-56
• 4.3.2 LvSRB-Croquemort基因的多序列比对及系统进化分析56-58
• 4.3.3 LvSRB-Croquemort基因在各组织内的表达观察58
• 4.3.4 LvSRB-Croquemort基因对不同病原体刺激的时序表达58-59
• 4.3.5 LvSRB-Croquemort基因通过dsRNA沉默后相关基因的表达59-60
• 4.4 讨论60-61
• 4.5 小结61-62
• 第五章 结论、创新点和展望62-63
• 结论62
• 创新点62
• 研究展望62-63
• 参考文献63-70
• 附录70-74
• 缩略词74-75
• 致谢75-76
• 作者简介76

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