小麦西农538几丁质酶基因的克

发布时间：2017-08-25 20:23

  本文关键词：小麦西农538几丁质酶基因的克隆、表达及功能分析

  更多相关文章： 西农538 几丁质酶 原核表达 组织表达 功能分析

【摘要】：几丁质酶是植物重要的防卫因子之一,与植物的抗病性密切相关。为了进一步扩充几丁质酶基因资源,深入了解其在小麦体内的表达特性及其功能,本研究利用通用引物ChiF/ChiR从不同的小麦材料中,克隆得到几丁质酶基因并对序列进行分析,与表达载体连接在大肠杆菌中进行表达,并利用荧光定量PCR (qRT-PCR)技术分析这些基因在西农538小麦根、茎和叶等不同组织中的表达情况。最后,选取在西农538小麦的根、茎和叶组织中表达量较高的2个几丁质酶基因进一步研究其与条锈病菌的抗性反应试验。结果表明：1.从10份具有不同抗病性的小麦材料中,均能够克隆得到5条长度约960 bp的几丁质酶基因序列,依次命名为Cht1、Cht2、Cht3、Cht4和Cht5。利用NCBI在线BLAST软件对这5条基因序列进行同源性比对,结果搜索到100条具有同源性的核苷酸序列,其中Cht5与来自于中国春的Chi-3基因(序列号KJ507387)完全一致,进而将剩余基因提交至GenBank,获得登录号为KR049247～KR049250。2.对新扩增到的Cht1～Cht4基因序列进行分析表明,这些基因均具有完整的开放阅读框,不含内含子,起始密码子均为ATG,终止密码子都是TAG。Chtl～Cht4的核苷酸和氨基酸序列之间的相似性分别为96.84%和91.02%。这四条基因编码的几丁质酶均属于亲水性蛋白,按照不同的分类方法,这些几丁质酶分别属于Class Ⅰ b类型,同时也属于糖苷水解酶第19家族,是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。将获得的4条氨基酸序列与NCBI中已知来源的不同类型的几丁质酶蛋白序列进行比对,并构建系统进化树,聚类结果显示,本研究中得到的几丁质酶属于Class Ⅰ型。3.SDS-PAGE分析表明,这四条基因对应的重组质粒均能够在表达菌株TranBL21(DE3)中以包涵体的形式表达一个33 kDa左右的特异蛋白,与目标蛋白大小一致。4. qRT-PCR分析表明,这5个几丁质酶基因均能够在西农538的根、茎和叶中组成型表达,但在不同组织中具有较大的表达差异：叶中表达量最高,根次之,茎中的表达量最低；同时,这5种几丁质酶基因在同一组织中的表达量也具有明显规律性：Cht4 Cht2Cht3Cht1Chi-3。说明本研究扩增到的几丁质酶基因可能参与了小麦的正常生长发育过程。5.选取相对表达量较高的Cht4基因和Cht2基因进一步验证其对真菌性病害的抗性反应,结果表明,这两个基因的表达均可以受到条锈病菌的诱导,并且Cht4基因表达量与Cht2基因相比更早的出现峰值。Cht4基因在高抗材料92R137中的表达量显著高于中抗材料西农538和感病材料铭贤169,并且均高于同等条件下接ddH20的表达量；Cht2基因在中抗材料西农538中的表达量显著高于高抗材料92R137和感病材料铭贤169,并且抗病材料中的基因表达量高于对照中表达量,但在感病材料铭贤169中该基因表达与对照差别不大。说明Cht4基因和Cht2基因可能参与了小麦叶部抗条锈菌的防御反应。
【关键词】：西农538 几丁质酶 原核表达 组织表达 功能分析
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S512.1;Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-20
• 1.1 几丁质酶的酶学特性12-13
• 1.2 几丁质酶的分布定位13
• 1.3 几丁质酶的分类13-15
• 1.3.1 根据系统分类法分类13-14
• 1.3.2 基于水解位点分类14
• 1.3.3 根据等电点分类14
• 1.3.4 根据催化部位氨基酸序列分类14
• 1.3.5 根据蛋白质结构分类14-15
• 1.4 几丁质酶的生物学作用15-17
• 1.4.1 参与植物的发育调控15-16
• 1.4.2 抑制真菌菌丝生长和孢子萌发16
• 1.4.3 参与共生固氮16
• 1.4.4 释放信号分子16
• 1.4.5 抑制细菌生长和分裂、虫类消化和发育16-17
• 1.5 植物几丁质酶的研究进展17-19
• 1.5.1 植物几丁质酶的体外抑菌研究17
• 1.5.2 植物几丁质酶的可诱导性17-18
• 1.5.3 植物几丁质酶的转基因研究18
• 1.5.4 小麦几丁质酶的研究进展18-19
• 1.6 本研究的目的及意义19-20
• 第二章 西农538几丁质酶基因的克隆及序列分析20-30
• 2.1 实验材料及其他20-21
• 2.1.1 植物材料20
• 2.1.2 仪器和设备20
• 2.1.3 试剂和培养基20-21
• 2.2 实验方法21-23
• 2.2.1 基因组DNA的提取21-22
• 2.2.2 目的基因的扩增及回收22
• 2.2.3 目的基因的克隆22-23
• 2.2.4 目的基因的生物信息学分析23
• 2.3 实验结果与分析23-30
• 2.3.1 几丁质酶基因的克隆23-24
• 2.3.2 核酸序列分析24-25
• 2.3.3 氨基酸序列分析25-27
• 2.3.4 系统进化分析27-30
• 第三章 西农538几丁质酶基因的原核表达及目的蛋白的鉴定30-35
• 3.1 实验材料及其他30-31
• 3.1.1 载体及菌株30
• 3.1.2 仪器和设备30
• 3.1.3 相关试剂30-31
• 3.2 实验方法31-33
• 3.2.1 提取质粒31
• 3.2.2 原核表达载体的构建31-32
• 3.2.3 重组质粒的诱导表达32
• 3.2.4 原核表达产物溶解性鉴定32-33
• 3.2.5 原核表达产物的纯化33
• 3.3 结果与分析33-35
• 3.3.1 原核载体构建及目的蛋白检测33-34
• 3.3.2 原核表达产物溶解性鉴定34
• 3.3.3 原核表达产物的纯化34-35
• 第四章 西农538几丁质酶基因的组织表达及功能分析35-41
• 4.1 实验材料及其他35
• 4.1.1 植物材料35
• 4.1.2 仪器和设备35
• 4.1.3 相关试剂(盒)35
• 4.2 试验方法35-38
• 4.2.1 样品采集35-36
• 4.2.2 RNA提取及RT-PCR36-38
• 4.3 结果与分析38-41
• 4.3.1 西农538几丁质酶基因的组织表达特性38-39
• 4.3.2 Cht4基因和Cht2基因在条锈菌侵染后的表达特性39-41
• 第五章 讨论与结论41-44
• 5.1 讨论41-43
• 5.1.1 西农538几丁质酶基因的克隆及序列分析41
• 5.1.2 西农538几丁质酶基因的原核表达41-42
• 5.1.3 西农538几丁质酶基因的组织表达特性分析42
• 5.1.4 Cht4基因和Cht2基因在条锈菌侵染后表达特性分析42-43
• 5.2 结论43-44
• 参考文献44-49
• 致谢49-50
• 作者简介50

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