水稻内生放线菌OsiSh-2生物防治稻瘟病特性研究

发布时间：2017-10-10 21:01

  本文关键词：水稻内生放线菌OsiSh-2生物防治稻瘟病特性研究

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【摘要】：水稻稻瘟病是一种由稻瘟病真菌(Magnaporthe grisea)引起的分布十分广泛且破坏性极强的水稻病害。它严重影响水稻的产量和粮食安全。目前,防治稻瘟病的手段主要是喷洒化学农药和选育优良的水稻抗性品种。但是长期大量使用化学农药会带来一系列严重的环境污染问题且损害人类的健康。而抗性育种极易引起稻瘟病真菌变异产生新的能快速适应抗性水稻品种的生理小种。近年来,生物防治以其环保、低毒、不会导致病原菌产生抗性的特点受到了研究者的广泛关注与高度重视。作为植物微生态系统的重要组成部分,定植在植物内部的内生菌可以通过与病原真菌争夺空间和营养物质抑制病原菌的生长,其产生的抗生素等次级代谢产物可以直接杀死病原菌。此外,内生菌也可以通过促进植物的生长提高植物的抗病性。本研究的目的是针对前期筛选出的对稻瘟病具有较好拮抗活力的水稻内生放线菌OsiSh-2,研究该菌抗稻瘟病能力,并分析其所产的生物活性物质,为该菌应用于生物农药的开发与实际应用提供理论依据。1基础培养特征实验表明OsiSh-2在十种培养基上培养时表现出放线菌的培养特征,基内菌丝：棕色、浅黄色或白色,气生菌丝：白色、灰色或黑色；除了ISP5都有丰富的孢子产生；无可溶性色素产生;其气生菌丝能分化出螺旋形的孢子链。OsiSh-2可以利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-果糖作为唯一碳源,能产过氧化氢酶,水解淀粉,液化明胶,不产生黑色素和H2S。16S rRNA序列比对结果显示OsiSh-2与涂链霉菌(Streptomyces endus)的相似度达到了100%。综合OsiSh-2的形态特征、培养特征、生理生化特征及遗传学特征我们将其鉴定为涂链霉菌(Streptomyces endus)。2利用平板对峙法检测OsiSh-2对不同稻瘟病真菌生理小种(Guy11、RB3、SO7、62)的拮抗能力,发现OsiSh-2对四株稻瘟病真菌都有较强的拮抗作用,其中对RB3的抑制作用最强,抑制率达到了75.3%。进一步实验表明OsiSh-2并没有产生气体性的拮抗物质,除去菌体的发酵液也具有很强的拮抗效果。环境扫描电子显微镜结果显示,OsiSh-2处理过的稻瘟病真菌RB3菌丝出现了膨胀和细胞质浓缩的现象,说明OsiSh-2分泌的一些物质能影响稻瘟病真菌的生长。大田试验结果显示,在稻瘟病发病之前喷洒浓度为107CFU/mL的OsiSh-2孢子液,稻瘟病的病情指数降低了48.19%。同时,处理过的水稻苗长比对照组高出了11.51cm。表明一定浓度的OsiSh-2孢子液喷洒于水稻的叶面对稻瘟病起到了很好的防治效果。3本论文对OsiSh-2的主要生物活性物质进行了研究。定性检测发现OsiSh-2可以产生与促生长相关的ACC脱氨酶、植物激素IAA和铁载体以及与拮抗真菌相关的蛋白酶、纤维素酶、明胶酶和过氧化物酶。OsiSh-2菌体的甲醇萃取液,PDA固体培养基的甲醇和乙酸乙酯萃取液对稻瘟病菌都有拮抗效果,其中,甲醇萃取液的拮抗效果明显比乙酸乙酯好。通过薄层层析(TLC)技术将OsiSh-2的PDA甲醇萃取液初步分离出了四个斑点且只有2号斑点具有拮抗效果。全波长扫描发现2号斑点在200-300nm处有最大吸收峰,推测OsiSh-2可能产聚醚类化合物。PCR检测结果显示OsiSh-2基因组内含有固氮相关的基因NifU,非核糖体多肽类物质合成基因NRPS和聚酮类化合物合成基因PKS。表明OsiSh-2可能通过产生具有拮抗真菌的各种酶及各种代谢产物等综合机制来提高水稻的抗病性。
【关键词】：水稻内生菌 涂链霉菌OsiSh-2 稻瘟病真菌 稻瘟病 生物活性物质
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.111.41;S476.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-23
• 1.1 水稻稻瘟病概况12-15
• 1.1.1 稻瘟病的发生与危害12
• 1.1.2 稻瘟病的致病菌12-13
• 1.1.3 稻瘟病菌的致病机理13-14
• 1.1.4 稻瘟病的发生特点14-15
• 1.2 稻瘟病的传统防治手段15-16
• 1.2.1 化学农药15-16
• 1.2.2 抗性育种16
• 1.3 生物防治的应用概况16-18
• 1.3.1 生物防治手段16-18
• 1.3.1.1 植物源生防因子17
• 1.3.1.2 微生物源生防因子17-18
• 1.4 内生菌的研究概况18-21
• 1.4.1 植物内生菌18-19
• 1.4.2 内生菌与宿主植物的关系19-20
• 1.4.3 内生菌促进植物的生长及提高宿主植物的抗性20-21
• 1.4.4 放线菌在稻瘟病防治方面的研究21
• 1.5 论文选题背景、研究内容与思路21-23
• 1.5.1 论文选题背景21-22
• 1.5.2 论文研究内容与思路22-23
• 第二章 水稻内生放线菌OsiSh-2的菌种鉴定23-34
• 2.1 前言23
• 2.2 材料与方法23-28
• 2.2.1 实验仪器23-24
• 2.2.2 实验试剂及培养基24-26
• 2.2.2.1 实验菌株24
• 2.2.2.2 实验试剂24-25
• 2.2.2.3 培养基及试剂配方25-26
• 2.2.3 实验方法26-28
• 2.2.3.1 OsiSh-2菌株形态的观察26-27
• 2.2.3.2 OsiSh-2菌株培养特征及生理生化实验27
• 2.2.3.3 OsiSh-2生长曲线测定及培养条件优化27
• 2.2.3.4 OsiSh-2 DNA的提取、16SrRNA基因的扩增及进化树的构建27-28
• 2.3 结果与讨论28-33
• 2.3.1 OsiSh-2的形态特征、培养特征以及生理生化特征28-31
• 2.3.2 OsiSh-2菌株16S rRNA序列及系统发育树分析31-32
• 2.3.3 OsiSh-2菌株培养条件的优化32-33
• 2.4 本章小结33-34
• 第三章 OsiSh-2体内体外拮抗稻瘟病菌性能分析34-43
• 3.1 前言34
• 3.2 材料与方法34-37
• 3.2.1 实验仪器34
• 3.2.2 材料与试剂34-35
• 3.2.2.1 实验材料34-35
• 3.2.2.2 试剂和培养基35
• 3.2.3 实验方法35-37
• 3.2.3.1 真菌孢子悬液的制备35
• 3.2.3.2 OsiSh-2拮抗稻瘟病真菌平板实验35
• 3.2.3.3 OsiSh-2发酵液拮抗稻瘟病真菌实验35-36
• 3.2.3.4 OsiSh-2产拮抗物质培养条件的优化36
• 3.2.3.5 OsiSh-2平板拮抗稻瘟病真菌电镜实验36
• 3.2.3.6 OsiSh-2大田防治稻瘟病实验36-37
• 3.3 结果与讨论37-42
• 3.3.1 OsiSh-2对稻瘟病真菌的体外拮抗效果37-40
• 3.3.2 OsiSh-2产拮抗物质培养条件的优化40-41
• 3.3.3 OsiSh-2在大田对稻瘟病的防治效果41-42
• 3.4 本章小结42-43
• 第四章 OsiSh-2产生物活性物质的研究43-54
• 4.1 前言43
• 4.2 材料与方法43-47
• 4.2.1 实验仪器43-44
• 4.2.2 试剂与培养基44-45
• 4.2.3 实验方法45-47
• 4.2.3.1 OsiSh-2产拮抗相关酶及促生长物质的检测实验45-46
• 4.2.3.2 OsiSh-2有机试剂萃取液拮抗实验46
• 4.2.3.3 OsiSh-2甲醇萃取液TLC实验46
• 4.2.3.4 OsiSh-2 2号斑点液相色谱及全波长扫描实验46-47
• 4.2.3.5 OsiSh-2与促生长及拮抗相关基因的检测实验47
• 4.3 结果与讨论47-53
• 4.3.1 OsiSh-2产拮抗相关酶及促生长物质的检测47-48
• 4.3.2 OsiSh-2拮抗物质的初步分离48-52
• 4.3.3 OsiSh-2与拮抗及促生长相关基因的检测52-53
• 4.4 本章小结53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-62
• 附录A 攻读学位期间发表的论文62-63
• 附录B 碱基序列63-64
• 致谢64

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