滇重楼根茎细菌多样性与根瘤菌系统发育基因组学研究

发布时间：2020-11-22 10:08

　　 进一步完善滇重楼人工栽培技术是其产业化发展的必由之路。除了优化种质资源、科学的田间管理之外,深入挖掘内生微生物资源也势必对滇重楼的可持续利用大有裨益。本论文针对滇重楼根茎内生细菌的多样性这一基本科学问题,通过选择性分离培养技术和高通量测序技术两种方法策略,对滇重楼内生细菌资源进行全面的分析和挖掘。同时多样性研究发现根瘤菌是优势类群之一,且通过分离培养得到一批相关菌株,因此论文围绕根瘤菌开展了深入的系统发育基因组学的研究。首先通过高通量测序技术,对云南省4个地区的滇重楼根茎内生及根际土壤环境细菌进行了生物多样性及群落功能的比较分析。两者中均蕴藏丰富的细菌类群,主要分布于放线菌门、厚壁菌门和变形杆菌门,但根际土壤的细菌类群多样性更高。细菌群落结构两者存在差异,在目级分类水平上,优势类群有异同、且有的类群在相对丰度上差异显著。通过对群落功能的预测和比较发现,根际土壤与根茎内生环境的群落功能也存在显著差异。此外,在对不同样点进行分析后发现,中甸样点根茎内生样本的细菌多样性较其他样点不同,但群落功能无明显差异,表明中甸样点根茎内生样本中的主要优势功能类群与其它样本一致。在随后的纯培养研究中,通过7种分离培养基的分离培养,共获得并鉴定云南6个地区滇重楼根茎内生细菌289株。相比免培养研究中检测到的优势细菌类群分布于3个门,18个目,83个属,纯培养分离到的菌株分布于同样的3个门,并分属于5个纲、14个目、25个科、42个属,其中包括22个潜在的新分类单元；在每个样点中都分离到不同于其它样点的属一级类群。此外,35株菌的发酵产物中检测到甾体皂苷类化合物；25株菌可在无氮源培养基上生长。对4个潜在新分类单元的菌株进行多相分类研究,确定了它们的分类地位。菌株py1111~T、Py1134~T为Rhizobium属的新种,分别命名为Rhizobium radicis sp. nov及Rhizobium gengmaense sp. nov.; py1294~T为Oceanobacillus属的1个新种,命名为Oceanobacillus endoradicis sp. nov.; py 1292~T为Yimella属的1个新种,命名为Yimellaradicis sp. nov.。通过测定41株Rhizobium属典型种基因组序列和系统发育基因组学研究,发现Rhizobium属及其近缘类群形成4个主要的进化分枝,多数具有共生固氮功能的典型Rhizobium属物种处于较晚的进化分枝上。对共生固氮相关蛋白的深入比较分析发现,共生质粒同源蛋白在Rhizobium属及其近缘类群中起源较早,基因缺失是造成一些物种丢失固氮作用的主要原因。共生固氮作用中的关键蛋白NifH、FixC和NodC在该类群中的平均相似性差异表明,它们在进化过程中受到不同的选择压力,或者个别基因存在横向基因转移的可能。从基因组层面深入分析了相关类群各物种之间的系统发育关系,阐明了共生固氮在Rhizobium属及其近缘类群中演化的主要机制。本论文的研究结果有助于理解根际土壤微生物菌群与滇重楼内生菌群之间的关系、全面认知滇重楼根茎内生细菌的物种多样性,并为积累与滇重楼有关的内生菌资源打下基础,更为人工栽培技术的优化提供理论指导。同时通过分离纯培养获得一批与滇重楼相关的内生细菌资源,为后期菌种资源开发提供宝贵的材料。围绕根瘤菌属及其近缘类群的系统发育基因组学理论研究,首次尝试从组学层面解决相关类群的系统分类学问题,并在该类群中共生固氮作用起源进化研究方面取得重要进展。与植物宿主相关微生物群落、菌种资源是微生物功能开发、群落生态、系统进化等研究的重要材料,相信随着高通量测序和纯培养技术的突破,植物内生微生物学研究将取得不断发展,并推动微生物资源的开发与利用。
【学位单位】：云南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S567.239;S182
【部分图文】：

云南大学博±学位论文??２．２．２实时巧光定量ＰＣＲ结果??通过实时巧光定量ＰＣＲ对来源于耿马、楚雄、中甸、弥勒及个旧这５个样点??的根茎内生及根际主壤样品中的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因及真菌ＩＴＳ基因进行了绝对定??量，定量结果如表２．１所示。５个不同样点的滨重楼根际主壤样品中，细菌与真菌??的数量大致相当，耿马、中甸、个旧的样品中真菌略占多数（分别为６４．２％，５９．７％，??６７．１％），楚雄和弥勒的样品中细菌略占多数（５６．５％，５４．１％）。与此不同的是，滨??重楼根茎内生菌在不同的样点中均细菌为主，占比达到９９．９％，只有Ｐ００２为??９５．６％；而真菌仅占极少量烟２．３）。该结果表明在演重楼根茎内生环境中，细菌??比真菌多；而根际止壤中两者数量基本相当。这也从一方面表明对演重楼根茎内??生样品进行细菌多样性研究的重要。??＾＂

第二章潰重楼根茎内生及根际王巧环境细免培养多样性研巧??维度上距离稍远，物种组成有不同。只有来自楚雄的其中一个样品作００７）与其他??植物内生样品偏离较明显，在图中位置居于根际±壌和其他植物内生样品之间，??考虑是否在样品处理过程中，表面消毒不彻底所致。同时，４个样点的根际±壤样??品聚在ＰＣｏＡ图右侧，尤其是中甸、弥勒、耿马的样品在图上坐标轴的距离较近，??表明它们的物种组成类似，而楚雄样品的位置稍远，这个结果与上节中通过Ａｌｐｈａ??多样性分析所揭示的结果一致。??

在Ｗ?ｗｅｉｇｈｔｅｄ构建的聚类树上与同来源于楚雄根际的样品Ｐ０２５聚在一枝，与ＰＣｏＡ??图得到的结果类似；而在ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ计算方法构建的聚类树上Ｐ００７与根茎内生样??品聚在一起。４个样点的植物内生样品在聚类图上交杂在一起，并没有表现出明虽??的样点间的差异。??２．２．３．５織巧群落功能巧諷??样品中ＯＴ化序列信息在ＫＥＧＧ数据库中影射的结果（图２．１０）显示，耿马漠??重楼根茎内生样品ＯＴＵｓ能够映射到的基因组功能信息比例最高，超过９０％；其??次分别为楚雄、中甸的内生样品，而弥勒２个样品的差异较大。前面的分析中，??己注意到楚雄的Ｐ００７样品与其他内生样品的群落多样性不同，而其在ＫＥＧＧ的未??匹配比例也较楚雄样点的其他２个样品离。根际±壤环境样品的未匹配比例均较??内生环境高，尤其是弥勒、中甸、耿马的样品有超过４０％的ＯＴＵｓ片段未在ＫＥＧＧ??数据库中影射到相关结果，说明±壌样品中存在大量未知的类群。??夏
【参考文献】

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本文编号：2894535