小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟

发布时间：2017-11-23 04:09

  本文关键词：小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟

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【摘要】：【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素和受体结合区域及关键氨基酸位点(热点残基),为了解毒素-受体互作机制及分子改造增强Cry毒素活性的研究打下基础。【方法】针对小菜蛾mALP全长设计引物,并以小菜蛾c DNA为模板扩增mALP基因,双酶切后用T4连接酶连接至pET-26b原核表达载体,将构建的pET-26b-mALP载体转化Trans1-T1克隆感受态,挑取克隆并提取质粒后进行PCR、双酶切和测序验证,将验证无误的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达感受态细胞,进行诱导表达。将诱导表达后的mALP转至PVDF膜上,通过Western blot和Ligand blot分别验证mALP是否成功表达以及是否具有与Cry1Ac毒素结合的能力。对mALP进行同源建模、分子动力学模拟以及模型评价,获得的mALP最佳三维结构与Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序进行分子对接试验,对确定的最佳毒素-受体复合物进行结合区域和结合氨基酸位点分析,并通过计算机辅助的丙氨酸突变扫描试验确定毒素和受体参与的关键氨基酸残基。【结果】扩增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)表达感受态后挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR、双酶切和测序均显示构建正确。通过原核表达和Western blot验证成功表达了mALP蛋白,并经Ligand blot试验证实了原核表达的mALP具有和Cry1Ac毒素结合的能力。利用同源建模成功获得了mALP的三维结构,通过Patch DOCK和Fire Dock分子对接程序,获得毒素和受体的对接复合物,通过溶剂可及表面积变化计算和Ligplot分析,确定毒素结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均参与了受体结合,并且毒素和受体均以疏水结合和氢键结合模式参与结合,最后通过热点残基预测发现Cry1Ac毒素和mALP中分别有3个氨基酸残基(376ASN、443SER和486SER)和4个氨基酸残基(452ARG、499THR、502TYR和513TYR)是参与互作的关键氨基酸位点。【结论】经原核表达的小菜蛾mALP同样具有与Cry1Ac毒素结合的能力,并利用分子模拟技术预测了小菜蛾mALP三维结构及与Cry1Ac毒素结合模式。
【作者单位】： 江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金(31401813、31630061) 江苏省自然基金-青年基金(BK20140744) 江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地自主研究课题(3201613)
【分类号】：S433.4
【正文快照】： 【研究意义】苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)可在其生命周期中产生一种专一性极强的晶体毒素(crystal toxin,Cry toxin),导致昆虫肠道细胞溶解或引发细胞凋亡程序,从而杀死昆虫[1-3]。Cry1Ac毒素作为应用最为广泛的一类微生物杀虫蛋白,在防治大量田间害虫中已取得

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