DNA甲基化在二斑叶螨个体发育及其两种色型差异中的作用研究

发布时间：2018-02-25 00:07

本文关键词： DNA甲基化 DNA甲基化转移酶二斑叶螨个体发育色型基因表达　出处：《南京农业大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：基因组的信息包括遗传信息与表观遗传信息两大方面。其中,遗传信息能够为生命所需的蛋白质提供一个蓝图,而表观遗传信息则能够指导这些遗传信息以何种形式,何地以及何时被生物体所利用。而作为其中最为重要并广泛存在于各生物中的就是基因的DNA甲基化作用。在真核生物中,DNA甲基化作用普遍发生在胞嘧啶的第五个碳上,因此又称为胞嘧啶甲基化作用。该过程的皮生是由一类称为甲基化转移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)的高度保守的酶所介导的。已有的大量研究证明,由甲基化转移酶所介导的DNA甲基化作用在真核生物正常的细胞分化、生长发育、表型变化以及其他重要的代谢过程中起到举足轻重的作用。因此,通过对生物中催化甲基化产生的甲基化作用机制系统进行详细了解,可以进一步明确DNA甲基化对发育及代谢调控的作用。二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)是一种世界性的农业害螨,能够危害多达1,100多种植物。如今,它以其发育历期短、易于饲养等独特的优点逐渐被应用于实验室内的遗传学研究。虽然二斑叶螨的发育历期较短,但是却具有较为复杂的发育可塑性。此外,二斑叶螨中具有单、双倍体决定性别的机制,受精卵发育成为雌性个体,而未受精卵的则发育成为雄性个体。发育成熟后的雌螨个体存在着典型的性二型现象。更有意思地是,在自然界中,二斑叶螨通常会以两种色型存在:一种是体色为黄绿色的绿色型;另一种则体色为洋红色的红色型,又称为朱砂叶螨[T.cinnabarinus(Boisduval)]。越来越多的证据支持这两种色型拥有相似的遗传背景,即可能是一个种有两个表现型的现象。而这种现象的产生很有可能是DNA甲基化作用所造成的。鉴于大量针对DNA甲基化调控表型变化的研究成果,DNA甲基化的这种调控作用是否会在二斑叶螨的个体发育以及两种色型形成的过程也得到延续,是值得探究的一个问题。为了解决以上的科学问题,本研究首次利用RACE技术对二斑叶螨中甲基化转移酶3基因(Tudnmt3)进行克隆,并利用生物信息学手段分析该基因的初级、二级以及三级结构。结果显示,Tudnmt3具有从头甲基化活性所必需的3个保守结构域(PWWP结构域、锌指结构域和催化活性结构域)与6个高度保守的模体。并且,二级与三级蛋白结构的预测结果同样反映出它与数据库中已知的甲基化转移酶3具有高度的保守性,且拥有与甲基化转移酶3构象的激活和稳定所必需的氨基酸残基。综上所述,一系列的生物信息学分析反映出Tudnmt3的确是属于从头甲基化转移酶3家族,结构更倾向于甲基化转移酶3a,推断Tudnmt3在二斑叶螨中是具有活性的,并且可能起到重要的从头甲基化作用。既然Tudnmt3基因具备着从头甲基化转移酶3家族所必需要的活性模体,也就说明它可能在二斑叶螨的个体的生长发育甚至基本代谢过程中起到重要的调控作用。因此,本研究中对二斑叶螨中的甲基化转移酶3可能起到的功能作用进行了初步的探究。荧光定量PCR的结果显示Tudnmt3在二斑叶螨的整个生活史中具普遍表达。但是,在雌雄不同性别的发育历期中表达模式并不相同。整体原位杂交的实验结果为Tudnmt3可能与雌雄成螨的性腺发育分化有关提供了有利的证据。后续的MSAP(methylation-sensitive amplification polymorphism)技术所获得的119个位点进行分析,表明了雌雄成螨的甲基化模式的略微不同,这样的结果暗示了雌雄成螨中DNA甲基化模式的不同可能是Tudnmt3的不同的甲基化活性所引起的。为了更好地阐述甲基化转移酶3在二斑叶螨雌雄成螨中的功能,本研究对雌雄叶螨中甲基化转移酶3蛋白的表达量,以及其在体内的定位进行了一系列的分析。蛋白印记的结果显示这个蛋白在两种性别中均有表达,但在雌成螨中显著高于雄成螨,这是与先前研究中该基因的转录水平的趋势是不一致的,可能暗示了该基因发生了翻译后修饰。后续的免疫荧光检测结果进一步证明了甲基化转移酶3在雌成螨中的表达量高于雄成螨,并且发现甲基化转移酶3是定位于细胞质中,且主要在叶螨的生殖区域表达,支持了先前的假设:在二斑叶螨中由甲基化转移酶3所介导的从头甲基化作用可能在性腺发育或者配子的形成有关,并且作用机制是不同于维持型甲基化转移酶的。先前的一系列研究证明了在二斑叶螨的个体发育过程中,从头甲基化转移酶所介导的DNA甲基化作用起到了一定的调控作用。基于现有的证据证明甲基化转移酶与社会型昆虫的级型变化有关,这个基因是否会在二斑叶螨两种色型的发育过程也发挥重要作用,尤其是否与体色分化有关,是值得研究的。本研究主要利用荧光定量PCR技术检测了Tudnmt3在二斑叶螨红色型(TuR)与绿色型(TuG)不同发育时期中的表达水平。结果显示,Tudnmt3基因在中国二斑叶螨两种色型的各个发育时期均具普遍表达,并且在发育过程中具有相似的表达趋势,随着龄期的增长,表达量逐渐下降。其中,卵的发育时期是表达量最高的,统计分析显示显著高于成螨阶段(P0.05)。从不同表型对应的相同阶段的分析,发现Tudnmt3基因的表达量是存在差异但只有在成螨阶段中的表达量达到统计意义,暗示了Tudnmt3基因所介导的从头甲基化作用在二斑叶螨两种色型的发育形成中可能发挥着一些作用。虽然从头甲基化作用可能在二斑叶螨的红、绿色型的体色形成过程中具有作用,但具体是否能够调控某些与色素合成相关的基因表达从而引起红、绿色型体色变化是未知的。因此,为了解决这一重要问题,我们利用转录组测序技术寻找两种表型之间与色素合成相关的差异表达基因,初步揭示可能引起两种色型变化的基因表达的分子机制。转录组测序的结果发现两种色型共有的与色素合成相关的基因有83个,其中11个是具有显著性差异表达的(FDR0.05)。其次,利用定量PCR技术检测10个基因在两种色型的体色的不同阶段的表达量,结果发现大多数基因在红色型中维持着高的表达量。同时,对犬尿氨酸3-羟化酶基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂27A基因进行亚硫酸氢盐法测序发现,在红、绿色型体色的不同阶段之间存在着甲基化水平的差异,但统计分析并不显著(P0.05)。最后,对红色型的成螨进行去甲基化抑制处理发现,犬尿氨酸3-羟化酶基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂27A基因的表达量均出现了极显著下调(P0.001),直接证明了 DNA甲基化对色素基因的表达具有直接的影响。与期望不符地是,低甲基化水平并未对红色型的体色以及其他生理指标产生影响。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.7

【参考文献】