堆肥过程中木质素降解及甲烷排放相关功能基因研究

发布时间：2018-02-27 02:02

  本文关键词： 堆肥化 功能基因 木质素降解 甲烷排放　出处：《湖南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：堆肥化作为一种有效处理农业废物的方法已经得到广泛的应用,堆肥过程中微生物与有机质相互作用、相互影响,成为影响堆肥进程的关键因素。木质纤维素是农业废物中的主要难降解有机物,木质素由于其结构复杂不易水解,且对纤维素和半纤维素的天然屏障作用,使得堆肥过程中木质纤维素难于降解。木质素是腐殖质形成的前体物质,因此木质素的生物降解成为堆肥过程的限速步骤。漆酶是木质素降解的三大功能酶之一,在自然界和堆肥化过程中木质素的降解中起着重要作用。传统观念认为真菌漆酶在自然界中木质素降解起重要作用,最近研究发现,细菌也能产漆酶,且某些细菌漆酶具有耐热性、耐碱性等优良特性,这些特性有助于它们在堆肥过程的高温、弱碱性环境中保持活性,因此可能在堆肥木质素的降解过程过程中发挥重要作用。基于以上猜想,我们分析了农业秸秆堆肥化过程中潜在产漆酶细菌种群结构变化及其对理化参数的响应。基于克隆文库的系统发育分析结果表明,堆肥期间的细菌漆酶基因多样性较为丰富,测得的序列与参考序列共形成13个进化枝。所测得的225个有效漆酶基因序列中与γ-proteobacteria,α-proteobacteria和Bacteroidetes相似度较高的漆酶基因序列占总数的86.2%,前两类序列存在于分析的所有样品中,Bacteroidetes相关序列仅降温期样品中没有出现。因此,这三个类别的序列为堆肥体系中的漆酶基因优势类群,其编码氨基酸很可能参与堆肥中的酚氧化酶活的合成和木质素的降解。鞘脂单胞菌目相关的序列为系统发育树上最大的分枝,该类序列在所分析的5个克隆文库中均有出现,特别是在高温期和降温期样品中占了非常显著的优势地位。对5个堆肥样品进行Jackknife Cluster和Uni Frac PCo A分析,结果表明堆肥4个时期的样品的分布具有明显的阶段性。Pearson和RDA多元分析结果均表明,温度、WSC、C/N和FA与堆肥过程中细菌漆酶基因组成结构的变化呈正相关,p H和HA与堆肥细菌漆酶组成负相关。在所有的环境因子中,温度对堆肥细菌漆酶基因结构的影响最大,另外显著性的影响因子为HA。HA与堆肥腐熟期样品的漆酶基因分布呈正相关,这与堆肥腐熟期腐殖质的形成相对应。在上一步工作基础上,本文继续分析了细菌、真菌和链霉菌漆酶基因对堆肥中木质素降解的贡献差异,在基因水平和转录水平上对三类微生物漆酶基因的进行了定量。结果表明,细菌和真菌漆酶基因及其转录水平都远高于链霉菌漆酶基因;细菌和链霉菌的漆酶基因及其表达量在堆肥过程中表现出相似的变化规律,高温期具有相对较高的细菌和链霉菌漆酶基因及表达丰度,而真菌漆酶基因拷贝数和表达量在堆肥高温阶段却有明显减少,表明堆体含有大量能适应堆肥环境的产漆酶细菌和链霉菌种群,且高温期环境能刺激其漆酶基因的表达,但是大部分产漆酶真菌可能无法适应堆肥的高温和弱碱性条件,导致漆酶基因丰度及其表达在高温期有所降低。相关性分析结果表明细菌和链霉菌漆酶基因表达与两个ph6.5和8.0下测得的酚氧化酶活呈显著正相关,表明细菌和链霉菌是堆肥过程中酚氧化酶的合成的主要参与者。尽管细菌漆酶基因转录水平与酚氧化酶活呈显著正相关关系,但是与木质素降解的正相关关系不显著,可能是因为堆肥过程中木质素的降解是由多种酶共同作用的结果,除了漆酶,许多其它的酶可能也参与了木质素的降解。真菌漆酶基因表达与木质素、半纤维素和纤维素的降解速度都呈负相关,这可能是因为真菌漆酶基因在堆肥环境下可能仅有少部分能表达并转化为有效的酚氧化酶活,因此无法在木质素降解过程中发挥主要作用。链霉菌漆酶基因转录与木质素降解速度呈显著正相关关系,表明堆肥过程中绝大部分链霉菌漆酶基因可能都表达并转化成了有效的酚氧化酶活,参与了木质素的降解。除了对堆肥体系中的漆酶基因进行分子生态学研究,本文还通过分离培养筛选出了一株产漆酶菌株哈茨木霉(hypocrealixiisp.c2),通过race扩增出了其cdna全长,并将其在原核细菌中进行了表达,纯化得到了漆酶蛋白,sds-page显示条带大小约为60kda。该漆酶的酶学性质显示,纯化后漆酶对多种研究底物的最适反应ph值为4.5,漆酶在ph7.0的环境下相对较为稳定,能适应较大的酸性ph范围,在碱性环境下酶活下降很快。新漆酶最适宜反应温度为35℃,在温度在20~50℃范围内漆酶酶活的变化相对平缓,而在50~70℃时,漆酶酶活下降很快。温度与漆酶稳定性关系的实验结果表明新漆酶对中温有一定适应能力,但在高温条件下较为敏感。对hypocrealixiisp.c2漆酶的底物特异性与动力学进行分析,比较abts、l-dopa和愈创木酚三种常见漆酶底物的动力学参数。结果表明新漆酶对三种底物的km值大小顺序为abts愈创木酚l-dopa,kcat/km大小顺序为abts愈创木酚l-dopa,表明abts新漆酶的最适反应底物。分析了金属离子对漆酶活性的影响,结果表明在一定浓度的k+、ba2+、mg2+、cu2+、ca2+环境下新漆酶能保持大部分的酶活,甚至在低浓度的情况下,还能不同程度刺激漆酶的催化活性,zn2+、mn2+、fe3+、hg2+对酶有抑制作用,其中hg2+的抑制作用最强,浓度在8mm时,酶活仅为41.8%。cu2+在三个浓度下对漆酶酶活均有刺激作用,特别是当cu2+浓度为8mm时,相对酶活达到了137.6%。考察了5种抑制剂edta、nan3、tga、ddc和乙醇对新漆酶活性的影响,结果显示随着抑制剂浓度的升高,抑制作用越显著。其中edta、nan3、tga、ddc的抑制作用非常明显,特别是当nan3的浓度为20μm时,新漆酶的活性完全被抑制,而乙醇对酶活的抑制作用相对较弱。复杂的环境污染物中含有不同的金属离子和酶抑制剂,因此,研究金属离子和抑制剂对漆酶活力的影响对于漆酶在环境污染物降解中的应用将起到重要的指导意义。控制堆肥过程中甲烷等温室气体的排放是堆肥化处理过程中又一个重要方面。本论文比较了好氧堆肥和厌氧堆肥在处理畜禽粪便过程中的甲烷排放量,同时分析了堆肥过程中与甲烷排放相关的两类微生物——产甲烷菌和甲烷氧化菌与甲烷排放的关系。甲烷排放分析结果表明,在50天堆置过程中好氧堆肥的CH4累计排放量明显低于厌氧堆,约为厌氧堆的1/3,因此好氧堆肥在甲烷排放量方面是明显优于厌氧堆的一种粪便处理方式。通过mcr A和pmo A基因分别表征产甲烷菌和甲烷氧化菌,分析产甲烷菌和甲烷氧化菌的丰度与甲烷排放之间的相关性,Pearson相关性和回归分析结果均表明好氧堆肥堆体表面甲烷排放量与mcr A基因丰度的对数值和mcr A:pmo A的比值呈显著线性正相关;厌氧堆堆体表面甲烷排放量与mcr A:pmo A的比值呈显著线性正相关。这一结果佐证了我们之前的假定,即堆肥过程中甲烷的净排放量取决于产甲烷的基因和甲烷氧化的基因之间的动态平衡。但是为了更加真实反映功能基因的活性状态,我们还将继续在转录水平研究mcr A和pmo A基因在堆肥过程中的表达活性,并分析其与甲烷排放的关系,以便提供更加真实反映微生物的在堆肥体系中的生态功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S141.4;X71
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本文编号：1540614