禾谷镰刀菌细胞壁形成相关基因及其 RNAi 片段功能鉴定

发布时间：2018-03-09 21:08

  本文选题：禾谷镰刀菌　切入点：RNA干扰　出处：《华中农业大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum,Fg)是引起禾谷类作物赤霉病(Fusarium head blight)的主要病原菌,随着全球温室效应的日益严重,赤霉病呈逐年蔓延之势。禾谷镰刀菌侵染可导致作物的产量和品质下降,严重时颗粒无收;此外,禾谷镰刀菌还会产生多种镰刀菌毒素,严重影响人畜健康。禾谷镰刀菌具有寄生范围广,不存在寄主专化型等特点,使得抗赤霉病研究工作举步维艰。采用化学杀菌剂防治赤霉病易造成环境污染以及有益生物的非靶标性杀灭;生物防治虽可以解决环境危害的问题,但具有防治效果不稳定的固有缺点。因此,开发新的赤霉病防治策略成为当前赤霉病研究工作的重要任务。RNA interference(RNAi)是真核生物中普遍存在的机制,利用RNA干扰技术防治作物病害成为目前作物病害防治研究工作的新手段。镰刀菌细胞壁是镰刀菌侵染植物过程中与植物最先接触的结构,起到保护镰刀菌细胞免受外界伤害的作用,同时也是镰刀菌保持致病力和正常发育的必需结构。本研究选取与镰刀菌细胞壁形成有关的基因作为研究对象,分析了候选基因在镰刀菌致病和生长发育过程中的作用,并筛选出了用于RNAi抗赤霉病的有效基因片段。主要包括4项内容:海藻糖六磷酸合酶基因(TPS1)和海藻糖六磷酸酯酶基因(TPS2)的功能鉴定;禾谷镰刀菌RNAi体系的建立;利用RNAi技术鉴定几丁质合成酶基因Chs3b的功能及有效RNAi片段筛选;镰刀菌单链抗体CWP2特异抗原乙二醛氧化酶(Glx)的功能鉴定。主要结果如下:1.TPS1、TPS2是禾谷镰刀菌中海藻糖合成的两个基因,本研究构建了禾谷镰刀菌TPS1、TPS2单基因缺失突变体(Δtps1,Δtps2)、TPS1和TPS2双基因缺失突变体(Δtps1-Δtps2)以及TPS1、TPS2回复突变体(TPS1C,TPS2C),三个突变体均丧失了海藻糖合成的能力。Δtps1和Δtps1-Δtps2在发育和致病力方面与野生型无显著差异,但影响毒素的合成能力,分别降低了67%和60%;TPS2基因缺失突变体表型与其他菌株区别明显,在PDA培养基上,Δtps2突变体生长缓慢,几乎不能形成气生菌丝;Δtps2完全丧失了产孢和有性生殖的能力;TPS2基因失活导致细胞向两极生长的趋势降低,而转为向侧面生长,利用CFW和DAPI染色发现,Δtps2分生孢子隔膜数减少,细胞核分布不均匀;Δtps2细胞壁超微结构改变,相应的几丁质含量和几丁质合成酶活性降低;Δtps2对小麦致病力极显著降低,降低量达到99%,同时毒素合成能力降低了86%;转录组分析显示,Δtps1、Δtps2和Δtps1-Δtps2分别有486、1885和146个特异基因差异表达;Δtps1和Δtps1-Δtps2表达模式类似,与Δtps2差异明显。2.建立了禾谷镰刀菌rnai体系,该体系包括用于禾谷镰刀菌单基因有效片段筛选的载体,禾谷镰刀菌双基因rnai载体,禾谷镰刀菌双启动子高效rnai载体以及禾谷镰刀菌rnai快速构建gateway载体系统。各载体如下:prnai是单基因有效片段筛选载体,可在smai和sacii酶切位点处导入基因片段的茎环结构,用于禾谷镰刀菌单基因rna干扰;prnai-linker是双基因rnai载体,可在smai/scai和sacii/swai酶切位点处连入基因片段的茎环结构,用于禾谷镰刀菌双基因rna干扰;prnai-dpromoter是双启动子rnai载体,可在smai和sacii酶切位点处连入基因片段的茎环结构,高效干扰靶基因表达;pdon201和psxsh-gatewayd分别是禾谷镰刀菌gateway构建体系的入门载体和目的载体,psxsh-gatewayd含有4段attl区域,只需pcr扩增靶基因的正向序列即可完成含茎环结构的rnai载体构建。3.chs3b基因是禾谷镰刀菌侵染小麦过程中表达量最高的几丁质合成酶基因;将chs3b基因以500bp左右为单位划分为5段(15-583nt,570-1149nt,1130-1629nt,1612-2134nt,2104-2685nt)进行rnai,各区段均可导致chs3b基因mrna转录水平下降,其中第1、3、5段引起的降低最大;当chs3b基因的第1、3、5段被干扰后菌株在正常的pda培养基上生长速率略低于野生型,向培养基中添加sds和h2o2的胁迫压后,第1、2、3、5段干扰转化子敏感性增加;chs3b基因第1段干扰转化子在有性生殖条件下培养10d时不能产生子囊壳,产孢条件下培养5d时产孢较野生型降低了50%,第2段干扰转化子有性生殖能力不受影响但产孢能力降低了64%;用cfw对各菌株的孢子和菌丝染色观察发现第1和5段干扰转化子的分生孢子隔膜数减少,孢子形态异常,菌丝出现膨大的结构;进一步分析转化子的几丁质含量发现,第2、3、5段干扰转化子几丁质含量显著降低,第4段干扰转化子菌株出现几丁质合成量上升的现象;通过苗期接种和花期接种鉴定致病力发现,除第4段干扰转化子外,chs3b基因的干扰转化子致病力显著降低;用生物信息手段分析chs3b基因的保守性发现,chs3b基因在镰刀菌中序列保守,其他物种中不存在脱靶效应;体外sirna干扰试验表明,sirna在禾谷镰刀菌孢子萌发阶段可进入细胞内,细胞壁是sirna进入镰刀菌细胞的主要屏障。4.westernblot证实镰刀菌抗体cwp2的特异抗原为乙二醛氧化酶蛋白glx;glx蛋白在镰刀菌中催化合成h2o2,cwp2可抑制glx催化生成h2o2的能力;利用gfp标记glx表明该蛋白位于镰刀菌细胞膜;分别构建禾谷镰刀菌产don菌株fg5035、产niv菌株fg54606、串珠镰刀菌fv5611和尖孢镰刀菌fo297的glx突变体,对菌株致病力进行了分析显示:尽管各镰刀菌glx缺失突变体生长与野生型无显著差异,但glx缺失突变体致病力显著降低且毒素合成能力下降;对毒素合成基因的转录本分析发现,GLX缺失突变体中毒素合成相关基因有不同程度的下调表达。综上所述,本研究鉴定了3个与镰刀菌细胞壁有关基因的功能,发现Chs3b基因和TPS2基因是禾谷镰刀菌致病及发育的关键基因,GLX基因编码蛋白是镰刀菌抗体CWP2的特异抗原,该基因与镰刀菌致病力和毒素合成有关;建立了禾谷镰刀菌RNAi的体系,并利用该体系筛选出了可用于RNAi抗赤霉病的有效基因片段Chs3b-1、Chs3b-3以及Chs3b-5。研究结果为抗赤霉病研究工作提供了有效的靶点以及理论支撑。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.4
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本文编号：1590262