罗伯茨绿僵菌中G蛋白偶联受体基因的敲除及功能分析

发布时间：2018-03-16 14:04

  本文选题：罗伯茨绿僵菌　切入点：G蛋白偶联受体　出处：《安徽农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：昆虫病原真菌绿僵菌(Materhizium)作为杀虫资源的种类之一,不仅具备真菌杀虫剂的所有优点,还具有安全、制剂易生产、货架期长等优点,被广泛研究。据不完全统计,目前全世界超过200种农林害虫能被绿僵菌制剂寄生致死。然而,绿僵菌同其他微生物体农药一样,也存在一些不足,例如昆虫致死时间长,杀虫效率较低,防效不稳定等,严重限制其大规模应用。因此,系统深入理解昆虫病原真菌致病的机制,可为高效杀虫菌株的选育提供理论依据。G蛋白偶联受体(GPCRs)是一类非常重要的信号分子受体,是真核生物中最大的一类跨膜蛋白家族。G蛋白偶联受体在胞外信号向胞内转导的过程中起到重要的作用,调节控制着细胞内的基因转录,细胞运动和生长。可以说GPCRs调控着几乎所有已知的生理过程,例如激素、生长因子、神经递质、气味和光等介导的生理行为等都有G蛋白偶联受体的参与。所以说,在生物体中,G蛋白偶联受体有着不容忽视的重要作用。丝状真菌虽然作为真核生物中最低等的部分,但是它们确是对人类生命活动的各个方面产生了深远的影响,所以为了控制丝状真菌对人类不利的一面,充分利用其有益的特性服务于人类,就必须深入的了解其生理、遗传以及分子生物学方面的信息,并通过分子生物学手段对其进行有效改造。近年来有很多丝状真菌的全基因组测序已经完成或正在进行即将完成,于是乎对具体基因功能的研究就无可避免的成为了丝状真菌研究的一个热点,而这其中利用反向遗传学的方法来敲除基因是研究丝状真菌功能基因的常用方法之一。在对野生型罗伯茨绿僵菌(Mr23)孢子悬浮液进行40℃的水浴热激,并对热激后所形成的的表达谱的分析中,结果显示G蛋白偶联受体的基因表达是明显上调的,所以我们可以推测得知在绿僵菌的抗逆境过程中,G蛋白偶联受体起着很重要的作用。于是本文采取用结合基因敲除技术和农杆菌介导遗传转化技术来完成对野生型罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)体内G蛋白偶联受体的基因功能的预测。首先查找出GPCRs在基因组中的位置,并找到其上游及下游序列,构建敲除的载体,通过将敲除载体转化至根癌农杆菌AGL-1中,获得含有敲除质粒的农杆菌菌株,将农杆菌菌株与野生型罗伯茨绿僵菌(Mr23)共培养,筛选出阳性菌株,即获得了绿僵菌的敲除株,用同样的方法构建回补突变的农杆菌菌株,用其与绿僵菌敲除株共培养,获得绿僵菌回补菌株。将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△MrGPCR::MrGPCR)进行相应的生物学特性的测定,抗逆性能的测定和相应毒力能力的测定,观察比较,得出结论。从目前的状况看来,在真菌中GPCRs的应用还是有限的,所以,在绿僵菌中研究GPCRs还是很有前景与价值的。所以本文采用用基因敲除技术与农杆菌介导遗传转化技术来研究GPCRs在绿僵菌体内的功能是具有一定的理论意义与实践应用价值的,创新性很明显。主要的研究结果结论如下:1.在NCBI中查找出G蛋白偶联受体的序列,并找到在基因组中的位置,并且成功的构建了敲除质粒和回补质粒,获得了敲除菌株和回补菌株。2.将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△Mr GPCR::MrGPCR)分别选取14天的菌种,并且将其配置成孢子悬浮液,选取30μL孢悬液涂板接种在1/4 SDAY、SDAY和PDA培养基上(包括3组技术重复和3组生物重复),分别于14天和20天计算其产孢量。结果可知,与野生型绿僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,敲除了GPCR的罗伯茨绿僵菌(△Mr GPCR)的产孢量有着明显的下降趋势。3.将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△MrGPCR::MrGPCR)接种在SDAY培养基上,分别提取其RNA,查找相关产孢量的基因,并且通过实时荧光定量PCR方法,所得结果,可知大部分与产孢相关的基因都有下调趋势,也是从分子的角度验证了上述(结论2)产孢量有明显下降的结果。4.将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△MrGPCR::MrGPCR)的孢子悬浮液点接在含有各种试剂的PDA培养基上,每隔相应的时间段观察其菌落生长直径。结果可知,与野生型绿僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,在NaCl、SDS、Congo red、H2O2和多菌灵抗性的培养基上,敲除了GPCRs的绿僵菌(△MrGPCR)对周围环境的逆境适应性变强了,即对逆境的敏感度下降了。5.将野生型罗伯茨绿僵菌菌株(Mr23),敲除菌株(△MrGPCR)和回补突变菌株(△Mr GPCR::MrGPCR)的孢子悬浮液均匀的涂在PDA培养基上,培养14天后收集孢子,配置孢子悬浮液,用新鲜配置的孢子悬浮液来浸泡大蜡螟,对大蜡螟进行体表侵染。所得结果,可知与野生型绿僵菌(Metarhizium robberstii ARSEF 23)相比,敲除了GPCR的绿僵菌(△MrGPCR)的侵染大蜡螟能力减弱了,即毒力降低了。综上所述,敲除了G蛋白偶联受体的绿僵菌在逆境中适应性变强,产孢量减少,毒力减弱。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.12

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 梁昌聪;彭军;黄志;谢玉萍;黄俊生;;绿僵菌发酵工艺的研究进展[J];热带农业科学;2008年06期

2 陈瑞勤;;紫外线-亚硝酸复合诱变选育高抗逆性绿僵菌的初步研究[J];河北省科学院学报;2008年02期

3 任巧云;殷宏;关贵全;马米玲;刘爱红;李有全;刘军龙;牛庆丽;金玉荣;罗建勋;;10种农药与绿僵菌的相容性测定[J];江西农业大学学报;2009年02期

4 李中元;刘静;张传博;;绿僵菌致病相关基因的研究进展[J];贵州农业科学;2009年04期

5 黄志;梁昌聪;杨腊英;刘磊;陆红霞;黄俊生;;绿僵菌农药助剂的筛选及混配防治荔枝蝽蟓的研究[J];安徽农业科学;2009年24期

6 张秋;;绿僵菌毒素的研究进展[J];安徽农业科学;2009年30期

7 常金梅;何衍彪;赵燕龙;柳凤;詹儒林;;绿僵菌致病力的制约因素研究[J];安徽农业科学;2010年06期

8 刘刚;;中科院完成杀虫绿僵菌比较基因组研究[J];农药市场信息;2011年03期

9 盛慧;;通用旋转组合设计优化绿僵菌发酵培养基的研究[J];黑龙江科技信息;2011年24期

10 于永浩;龙秀珍;曾宪儒;韦德卫;曾涛;;绿僵菌防治蛴螬的应用研究进展[J];南方农业学报;2013年01期

相关会议论文 前10条

1 林立辉;付延荣;;绿僵菌毒杀蚊幼虫的影响因素[A];《中国虫生真菌研究与应用》（第一卷）[C];1986年

2 程美真;张玉琢;陈祝安;谢佩华;黄基荣;;绿僵菌防治豆田蛴螬试验[A];全国生物防治学术讨论会论文摘要集[C];1995年

3 郭素萍;徐一强;祁学忠;赵俊生;;绿僵菌研究的新进展[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年

4 张礼生;张泽华;高松;农向群;;绿僵菌致病病理学研究热点[A];科技创新与绿色植保——中国植物保护学会2006学术年会论文集[C];2006年

5 郭素萍;麻秀芳;;绿僵菌研究的新进展[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年

6 樊美珍;郭超;;绿僵菌对土壤害虫的防治及其持效性[A];中国虫生真菌研究与应用[C];1991年

7 刘作易;;澳洲对绿僵菌的研究及其应用[A];《中国虫生真菌研究与应用》（第四卷）[C];1996年

8 农向群;李存焕;张泽华;魏海燕;;绿僵菌防治高尔夫草坪蛴螬的效果[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年

9 林立辉;付廷荣;;几种培养基对绿僵菌生长及产毒能力的影响[A];《中国虫生真菌研究与应用》（第一卷）[C];1986年

10 赵俊生;贺沛芳;郭素萍;武慧真;;利用绿僵菌防治鳞翅目害虫研究[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展（下册）[C];2001年

相关重要报纸文章 前4条

1 本报记者 张红;引进绿僵菌只是开始[N];人民日报海外版;2009年

2 王浩;杀蝗绿僵菌田间示范4万亩[N];农资导报;2004年

3 王中康;杀蝗绿僵菌油悬浮剂 今年田间示范4万亩[N];农民日报;2004年

4 本报记者 张红;青出于蓝而胜于蓝[N];人民日报海外版;2003年

相关博士学位论文 前5条

1 周刚;绿僵菌多菌灵抗性评价与罗伯茨绿僵菌组氨酸激酶及腺苷酸环化酶的生物学功能分析[D];浙江大学;2011年

2 单乐天;绿僵菌的杀蚜潜力评价与球孢白僵菌、绿僵菌及玫烟色拟青霉的孢子疏水性相关特征的解析及利用[D];浙江大学;2009年

3 王楚桃;绿僵菌侵染蝗虫差异糖蛋白及其酪氨酸蛋白磷酸酶在寄主血淋巴中的靶标蛋白分析[D];重庆大学;2007年

4 张伟;绿僵菌和蝗虫中具有降解昆虫体壁功能蛋白酶基因的分离、克隆及功能研究[D];重庆大学;2007年

5 李永丹;蝗虫EPV sph基因及OaEPV与绿僵菌及化学农药混用的杀虫效果[D];中国农业大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 王韦;基于转录组测序的绿僵菌MaCdc42调控机制解析[D];贵州师范大学;2016年

2 赵晶;绿僵菌紫外诱变及高毒力菌株的筛选[D];华南农业大学;2016年

3 石佑慧;蝗绿僵菌MabrlA在产孢调控作用和致病机制中的功能研究[D];重庆大学;2016年

4 杜民杰;水杨酸代谢在绿僵菌抗逆和致病中的作用[D];重庆大学;2016年

5 周荣;罗伯茨绿僵菌中G蛋白偶联受体基因的敲除及功能分析[D];安徽农业大学;2015年

6 何超;布氏白僵菌和黄绿绿僵菌对几种植物病原菌的拮抗作用研究[D];安徽农业大学;2015年

7 韩小勇;河北地区土壤绿僵菌特性研究[D];河北农业大学;2010年

8 吴小双;土壤细菌抑制绿僵菌作用机理的初步研究[D];中国林业科学研究院;2015年

9 李敏;绿僵菌磷酸甘露糖异构酶基因的克隆及功能分析[D];重庆大学;2011年

10 崔倩倩;防治小菜蛾高效绿僵菌工程菌的构建[D];中国农业科学院;2013年

，

本文编号：1620239