基于荧光报告载体的农杆菌atu5117基因启动子表达调控影响因素的研究

发布时间：2018-04-09 03:42

  本文选题：农杆菌T-复合物招募蛋白　切入点：atu5117基因启动子　出处：《扬州大学》2015年硕士论文

【摘要】：农杆菌是一类能够在土壤中生存的植物病原菌。根癌农杆菌能侵染受伤植物细胞,将自身基因插入到植物基因组内遗传表达,借助农杆菌的侵染,可实现外源基因向植物细胞的转移和整合,通过植物组织培养技术,即可再生出转基因植株。农杆菌介导的遗传转化是植物转基因和植物遗传改良的首选方法,但其转化效率低和转化结果的不可预测性是该转基因技术面临的重要问题。农杆菌介导的遗传转化是一个复杂的过程,涉及到农杆菌细胞附着在植物细胞伤口,T-DNA在农杆菌和宿主细胞中的转移,T-DNA整合到宿主细胞及在宿主细胞内的遗传转化等多个过程。我们尝试进一步了解农杆菌T-DNA转运过程的分子机理,探讨是否可以通过提高T-复合物招募蛋白VBPs在农杆菌细胞内的表达活性来提高T-DNA的转化效率,此研究对其在植物转基因方面的应用具有重要意义。本文对编码农杆菌T-复合物招募蛋白VBPs的基因atu5117启动子表达调控机理进行了研究。在农杆菌启动子基因表达调控机理的研究中,多以单荧光gfp基因作为启动子报告基因,但是表达产物除了受启动子因素的影响外还受载体拷贝数的影响,以往的单荧光gfp检测方法不能排除载体拷贝数的干扰,使实验存在很大的误差。为了解决上述问题,本实验构建双荧光指示载体pUCA19-GFP/RFP红色荧光蛋白rfp基因作为载体拷贝数的报告基因,以便了解不同实验条件下atu5117启动子基因表达调控过程中载体拷贝数的影响。将带有,rfp基因的组成型表达的农杆菌atu3617启动子和带有gfp基因的农杆菌atu5117启动子与农杆菌表达载体pUCA19连接,构建出双荧光指示载体pUCA19-GFP/RF P,通过检测该载体在不同菌种和不同环境条件下的荧光表达活性的不同,来对atu5117启动子的表达调控机理进行研究。通过荧光检测农杆菌重组载体pUCA19-GFP/RFP能发出红绿荧光,通过基因组测序检测农杆菌重组载体pUCA19-GFP/RFP含有双荧光报告基因片段。检测结果表明农杆菌双荧光指示载体pUCA19-GFP/RFP构建成功。通过不同浓度蛋白测定荧光强度显示,荧光强度与荧光蛋白表达量之间存在线性关系。在大肠杆菌异源表达调控实验中,大肠杆菌中atu5117启动子的表达活性明显高于在农杆菌GMI9017和农杆菌GMI9017Δ2中的表达活性,atu5117启动子活性随着生长期变化,在对数期活性最高,可以推测atu5117启动子的启动表达具有一定的时序性。在不同生长条件下,大肠杆菌中的农杆菌atu5117启动子活性不受AS浓度影响,可能因为大肠杆菌中没有VirA-VirG等AS的响应机制。在碱性pH环境下,atu5117启动子启动表达活性变化不规律,在酸性pH环境下活性上升趋势明显,可能与农杆菌侵染植物过程中对酸性物质的趋化性相关。启动子活性受温度的影响明显,atu5117启动子活性随着温度上升,可能与细胞抵御高温的机制有关。在农杆菌表达调控实验中,atu5117启动子活性随着生长期变化,启动子活性在对数期达到最大。在缺失同源基因atu4860的GM9017△2中,农杆菌atu5117启动子的表达活性高于在GMI9017中的表达活性,atu5117启动子与同源基因tu4860启动子之间存在某些调控关系。在不同温度和pH条件下,启动子活性变化和在大肠杆菌中类似。AS浓度影响的实验中,atu5117启动子活性变化不规律,其机理有待进一步研究。
[Abstract]:Agrobacterium - mediated genetic transformation is one of the most important methods for the transfer and integration of exogenous gene to plant cells .

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.4

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本文编号：1724721