铜绿假单胞菌GF31的拟除虫菊酯类农药降解酶的分离纯化和特性研究

发布时间：2018-04-18 10:15

本文选题：铜绿假单胞菌 + 拟除虫菊酯　；参考：《广西大学》2015年博士论文

【摘要】：拟除虫菊酯类农药是目前世界上使用最广泛的杀虫剂之一,在环境中的残留和积累,给人类健康和生态系统造成了巨大的威胁。生物降解因为其高效、安全、无二次污染,已成为农药残留修复的有效措施。本文首先对一株本实验室前期筛选到的拟除虫菊酯高效降解菌株GF31进行了16S rDNA分子进化分析,鉴定其为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),并提交中国普通微生物菌种保藏中心保藏(CGMCC 7173) 。对GF31的菊酯降解酶的定域实验表明,酶活力主要位于胞外,占总酶活的81.5%, 说明其为胞外酶,这与目前普遍报道的胞内菊酯降解酶不同。对产酶培养基进行了优化,得到最优培养基组成为：废糖蜜5 g/L,蛋白胨10 g/L, NaH2PO4 0.12 g/L,苯丙氨酸1.0 g/L。培养到12 h时,再加入0.1%的吐温80。菌株GF31的产酶量增加约2.6倍,为后续开展降解酶分离纯化和结构性质等研究奠定了基础。根据GF3的菊酯降解酶的基本性质设计出一套分离纯化方案,经过超滤、盐析、离子交换和凝胶层析四步纯化,菊酯降解酶最终纯化倍数为32.8倍,酶活回收率为26.6%,比酶活达到2571.9 U/mg。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,表明纯化酶已达电泳纯,分子量约为53 KDa。对降解酶进行鉴定和结构表征,测得其质谱分子量为51 KDa,结合SDS-PAGE凝胶电泳结果,说明该酶是一个单亚基蛋白。测得其N-端氨基酸的顺序为：NH2-Thr-Pro-Gly-Lys-Pro-Asn-Pro-Ser-Ile-Cys。经还原和非还原的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明降解酶分子内可能含有二硫键；糖基化测定结果表明降解酶不含或仅含极少量的糖。对纯化酶的肽指纹图谱进行数据库检索结果表明其与来源于Pseudomonas aeruginosa M18和PAO1的假定的氨肽酶具有很高的相似性,认为可能为同一种蛋白。根据Pseudomonas aeruginosa PAO1的aminopeptidase基因序列设计引物,通过PCR获得了铜绿假单胞菌GF31的菊酯降解酶基因APs(在GeneBank中登记号为KT735188),并成功实现APs在大肠杆菌宿主中的异源表达。对菊酯降解酶基因APs进行生物信息学分析,结果表明该酶由536个氨基酸组成,前24个氨基酸为信号肽,第25-36个氨基酸为前导肽,随后是500个氨基酸残基的成熟蛋白,分子量为53.7 KDa,与纯化蛋白的分子量相符。蛋白保守域分析和氨基酸序列分析的结果表明,菊酯降解酶APs属于锌-肽酶超家族(M28家族)的氨肽酶,具有氨肽酶典型的催化三元体(Glu341, Ser423和His296)以及与Zn配位的5个氨基酸残基His296, Asp308, Glu341, Asp369,和His467。这是目前为止第一个报道的具有拟除虫菊酯降解能力的氨肽酶。对菊酯降解酶APs的一级结构进行了分析,与纯化酶的氨基酸组成结果基本一致,仅Glu、GlyPro的含量误差较大；对其二级结构进行了预测,结果表明α螺旋含量为32.8%,p折叠含量为20.6%,无规则卷曲的含量为46.6%；以PDB蛋白质数据库中相同性最高的灰色链霉菌属Streptomyces griseus氨肽酶为模板,利用同源建模法获得APs三级结构预测图。对菊酯降解酶进行了比较系统的降解特性研究,为该酶的实际工程应用提供理论依据。该酶的最适降解pH值为7.0,最适降解温度为60℃；在70℃以内,pH5.0～9.0范围内均可保持良好的活性,表明该酶具有优良的稳定性；Ag+、Hg+和Cu2+对该酶有明显的抑制作用,而其它金属离子对其活性影响不大。离子螯合剂EDTA和phenanthroline对菊酯降解酶活力没有抑制作用,说明菊酯降解酶活力不依赖于金属离子。表面活性剂SDS和Triton X-100能够明显抑制菊酯降解酶活力。菊酯降解酶能催化降解氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等多种拟除虫菊酯,其中对氯氰菊酯降解活力最高。反应动力学参数的测定结果表明,以氯氰菊酯为底物时,Vmax= 0.0017μM/s, Km=47.7μM,kcat=0.008 s-1;以L-亮氨酸.对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物时,Vmax= 0.99μM/s, Km=2668.8μM,kcat=183.3s-1。表明菊酯降解酶能更高效的催化pNA底物,进一步确认其属于氨肽酶。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X592;X172

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