灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析

发布时间：2018-05-02 22:22

  本文选题：灰葡萄孢 + BcKMO　； 参考：《华北农学报》2017年01期

【摘要】：为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。
[Abstract]:In order to construct the prokaryotic expression vector of uranine monooxygenase Bc KMOgene, a purified Bc KMO protein was obtained. Bc KMO gene was amplified by reverse transcription PCR from wild type BC22 of grapevine. The Bc KMO gene fragment was recovered and cloned into p MD19-T vector. After sequencing correctly, p MD19-T-Bc KMO and p GEX4T-1 plasmid with GST label protein were digested. The target fragment was ligated to construct the prokaryotic expression vector p GEX4T-1-Bc KMO-GST. of BC KMO gene. After restriction endonuclease digestion and sequencing, the constructed prokaryotic vector was transformed into Escherichia coli BL21. Bc KMO protein fused with GST tag protein was successfully expressed in Escherichia coli BL21 strain induced by IPTG. The size of Bc KMO protein was about 71 k Da.SDS-PAGE analysis. The protein was highly expressed 12 h after induction with 0.2 mmol/L IPTG. The results showed that the target protein could react specifically with the specific antibody of GST, which indicated that the Bc KMO gene was successfully expressed in vitro.
【作者单位】： 河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室;
【基金】：河北省高等学校科学技术研究项目(ZD2016001)
【分类号】：S432.44

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本文编号：1835732