致病疫霉Pi-PIPK-D8功能的研究与分析

发布时间：2018-08-27 19:01

【摘要】：致病疫霉是一类世界性分布的毁灭性的植物致病菌,其有性生殖对该物种的生存及演化非常重要,但分子机理至今尚未阐明。在疫霉菌属中发现一类新的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCR),在其七次跨膜结构域的C端偶联有一个磷脂酸肌醇激酶结构域(Phosphatidylinositol phosphate kinase,PIPK),该蛋白家族被命名为GPCR-PIPKs (GKs),共包括12个成员。本研究初步对致病疫霉GKs家族的Pi-PIPK-D8基因功能进行了研究分析。以致病疫霉HQK8-3为研究材料,通过绿色荧光蛋白表达载体建立了致病疫霉的遗传转化体系；通过实时定量RT-PCR技术,对致病疫霉不同发育阶段的组织器官中Pi-PIPK-D8基因的表达进行了检测；克隆致病疫霉Pi-PIPK-D8 cDNA蛋白编码区,构建了Pi-PPK-D8荧光蛋白融合表达载体,对Pi-PIPK-D8的亚细胞定位进行了检测；通过电转化将Pi-PIPK-D8的干扰载体pSTORA (A1935)转入致病疫霉中,对干扰菌株的表型进行了分析,以揭示Pi-PIPK-D8基因的功能。实验结果表明：(1)直接电转化法对致病疫霉来说是一种可行的遗传转化方法,该法的转化率约是原生质体转化方法的2倍,且比原生质体转化法更加简单、快速；(2)致病疫霉菌株HQK8-3的Pi-PIPK-D8 cDNA蛋白编码区序列为3045bp长,编码的蛋白质含1015个氨基酸,与NCBI公布的序列长度及编码蛋白质氨基酸数量相同。但该cDNA序列与NCBI公布序列有9个碱基差异,其编码的蛋白质氨基酸序列与NCBI公布序列有3个氨基酸差异；(3)致病疫霉Pi-PIPK-D8在致病疫霉HQK8-3的休止孢中相对表达量最高,在萌发包囊、孢子囊、游动孢子和营养菌丝中依次减少；(4)致病疫霉Pi-PIPK-D8蛋白可能定位于菌丝内的颗粒状结构中；(5)致病疫霉Pi-PIPK-D8沉默导致菌株的菌丝生长稀疏,孢子囊及游动孢子数量减少,与相反交配型菌株有性生殖产生的卵孢子数量减少,说明该基因参与致病疫霉菌丝的生长、孢子囊的产生和有性生殖。本研究揭示了致病疫霉Pi-PIPK-D8参与致病疫霉生长发育。对今后揭示致病疫霉一些重要生命现象的分子机理以及对该病害的有效防治具有重要的意义。
[Abstract]:Phytophthora infestans are a class of destructive plant pathogens distributed worldwide. Their sexual reproduction is very important to the survival and evolution of the species, but the molecular mechanism has not been elucidated up to now. A novel G-protein-coupled receptor (G protein coupled receptors,GPCR) was found in the genus Phytophthora, with a phosphatidylinositol kinase domain (Phosphatidylinositol phosphate kinase,PIPK) at the C-terminal of its seventh transmembrane domain. The family was named GPCR-PIPKs (GKs), which consists of 12 members. In this study, the function of Pi-PIPK-D8 gene in GKs family of Phytophthora infestans was preliminarily studied and analyzed. The genetic transformation system of Phytophthora infestans was established by using green fluorescent protein expression vector and real-time quantitative RT-PCR technique. The expression of Pi-PIPK-D8 gene in tissues and organs of Phytophthora infestans at different developmental stages was detected, the Pi-PIPK-D8 cDNA protein coding region of Phytophthora disease was cloned, the fusion expression vector of Pi-PPK-D8 fluorescent protein was constructed, and the subcellular localization of Pi-PIPK-D8 was detected. The interference vector pSTORA (A1935) of Pi-PIPK-D8 was transformed into Phytophthora infestans by electroporation. The phenotype of the interfering strain was analyzed in order to reveal the function of Pi-PIPK-D8 gene. The results showed that: (1) Direct electroporation was a feasible genetic transformation method for Phytophthora infestans. The transformation rate of this method was about 2 times of that of protoplast transformation and was simpler and faster than that of protoplast transformation. (2) the sequence of Pi-PIPK-D8 cDNA protein coding region of HQK8-3 was 3045bp long, and the encoded protein contained 1015 amino acids, which was the same as the length of the sequence published by NCBI and the amount of amino acid encoding protein. However, there were 9 bases difference between the cDNA sequence and the published sequence of NCBI, and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA sequence was different from that of the published sequence of NCBI. (3) the relative expression of Pi-PIPK-D8 was the highest in the endosporal spores of Phytophthora infestans HQK8-3, and it was found in the germinating cysts. The number of sporangium, zoospore and vegetative hyphae decreased in turn; (4) the Pi-PIPK-D8 protein of Phytophthora disease may be located in the granular structure of mycelium; (5) Pi-PIPK-D8 silencing of Phytophthora pathogenicus resulted in sparse growth of hyphae, and decreased the number of sporangium and zoospore. On the contrary, the number of oospores produced by sexual reproduction of mating type strains decreased, indicating that the gene was involved in the growth of Phytophthora, sporangium production and sexual reproduction. This study revealed that Phytophthora Pi-PIPK-D8 was involved in the growth and development of Phytophthora. It is of great significance to reveal the molecular mechanism of some important life phenomena of Phytophthora infestans in the future and to control the disease effectively.
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.4

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本文编号：2208152