精喹禾灵降解菌株的分离、鉴定及其降解关键酶的基因克隆与表达

发布时间：2018-10-18 21:09

【摘要】：精喹禾灵是一种高选择性的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂,主要应用于棉花、大豆、油菜等阔叶作物田中一年生或多年生禾本科杂草出苗后的防治。其作用机制是通过抑制乙酰Co A羧化酶,破坏分生组织生长,使杂草坏死。精喹禾灵的广泛使用及其在环境中的残留和积累造成了全球性的环境污染和生态破坏。除了直接对土壤环境、水环境和大气环境造成污染,精喹禾灵还能通过食物链在生物体内富集,对生物特别是人类的健康造成危害。因此解决其在环境中的残留问题已经成为世界各国研究的热点。精喹禾灵在环境中可以通过物理、化学和生物的方法进行降解。其中,微生物降解因其投入少,避免二次污染等特点正日益受到人们的重视。本研究的意义在于,筛选高效精喹禾灵降解菌株,研究其降解特性,以期为精喹禾灵污染环境的修复提供理论依据;同时克隆精喹禾灵降解关键酶的基因,实现其高效表达,从而进一步研究降解关键酶的酶学特性和催化机理。本研究采用富集培养法从安徽境内精喹禾灵生产厂家的污水处理系统中分离到一株高效精喹禾灵降解菌株QE-9。根据表型特征、生理生化特征以及16S r RNA系统发育分析,将其鉴定为Ochrobactrum sp.QE-9。菌株QE-9在温度20-42℃范围内生长良好,最适生长温度为30℃,最适生长p H为7.0;最适生长碳氮源为葡萄糖和酵母粉;氯霉素抗性。菌株QE-9的最适降解温度为30℃;最适降解p H为8.0;降解速率与接种量成正相关;能够在以精喹禾灵为唯一碳源的无机盐培养基中生长,并在6 d内对0.5 mmol?L-1的精喹禾灵降解率达到98%以上。采用SDS高盐法从精喹禾灵降解菌株Ochrobactrum sp.QE-9中提取高质量基因组DNA,通过鸟枪法构建基因组DNA文库,以透明圈为筛选标记从大约12000个转化子中筛选到一个阳性克隆子。通过序列测定和分析发现阳性克隆子的外源片段共有三个阅读框(orf1-orf3),分别编码β-内酰胺酶、吡哆醇5’-磷酸氧化酶和膜蛋白。其中,orf1被命名为基因estqe,该基因长1149 bp,编码382个氨基酸,在起始密码子GTG的上游找到了㧟35区(TTCCCC)、㧟10区(TGCAAGAAT)以及距起始密码子上游8 bp处的核糖体结合位点(AAGAGG)。基因estqe编码的Est QE蛋白氨基酸序列与来自Pseudomonas stutzeriβ-内酰胺酶的氨基酸序列(AHY43609)具有99%的同源性。进一步对Est QE氨基酸序列进行比对分析发现,该序列中含有酯酶第八家族以及C类β-内酰胺酶典型的保守序列SCTK(S-X-X-K)以及另外两个在酯酶第八家族成员中常见的L-L-X-H-X-X-G和YSN序列,但是在Est QE氨基酸序列中并没有发现传统酯酶家族的保守序列G-X-S-X-G,这一现象在其他酯酶第八家族成员的研究中也发现过。菌株QE-9不能在含有100 mg?L-1 Amp或PCN等β-内酰胺类抗生素的LB平板上生长,说明Est QE并没有β-内酰胺酶活性,猜测是由于蛋白演化过程中三维结构发生变化导致空间位阻使得蛋白活性的改变。Est QE氨基酸序列的系统发育结果表明关键酶Est QE与来自Pseudomonas fluorescens的酯酶第八家族成员Est C(AAC60471)有最高的同源性(68%),属于酯酶第八家族。另外,Est QE与其他AOPP类除草剂水解酶,精恶唑禾草灵水解酶Fe H(JF970231,KF601763,KP307927)、氰氟草酯水解酶Chb H(ADW65729)的同源性分别为34.7%、34.9%、12.5%和16.4%。PCR扩增基因estqe连接到表达载体p ET-29a(+)上构建重组表达质粒,实现了estqe在E.coli BL21(DE3)中的高效表达,通过镍离子亲和层析的方法对表达产物进行纯化研究其酶学特性。纯化后Est QE等电点约为6.5,自然状态下的分子量为43 k Da与理论数值基本一致,说明Est QE是一个单体酶。LC-MS鉴定结果表明Est QE可以通过酯键的水解将精喹禾灵转化为精喹禾灵酸,从而进一步证明Est QE是一个酯酶。以精喹禾灵为底物对Est QE的酶学特性进行研究。结果显示,其在25-55℃范围内其有很高的酶活力,最适反应温度为45℃;4℃保存2个月仍能保持93%的酶活力,50℃处理1 h酶活力也能保持在40%以上,说明其具有很高的热稳定性。在p H 5.0-9.0范围内Est QE都表现出较高的酶活力,p H 8.0时酶活力最高,p H 7.0到p H 9.0范围内较为稳定。1.0 mmol?L-1的Cu2+能严重抑制酶活性,而1.0 mmol?L-1的Ca2+和Mg2+则能分别将酶活力显著提高至142%和122%;10mmol?L-1的蛋白抑制剂PMSF、p CMB、DEPC和1%的表面活性剂SDS能强烈抑制Est QE的活性。此外,Est QE能够广泛水解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂,对各底物的催化效率为:精喹禾灵㧐精VA唑禾草灵㧐炔草酯㧐氰氟草酯㧐喹禾糠酯㧐高效氟吡甲禾灵。Est QE水解精喹禾灵的Km为142.6μM,Kcat值为48.2 s-1,催化效率值(Kcat/Km)为338s-1?m M-1。以上结果表明Est QE在芳氧苯氧丙酸酯类除草剂污染环境的修复方面具有巨大的应用前景。
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【学位授予单位】：淮北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X172;X592

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