大白菜抗根肿病基因CRb的分离克隆与功能鉴定

发布时间：2018-10-22 14:54

【摘要】：十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)侵染引起的一种世界性病害,严重危害十字花科作物的正常生产。CRb基因位于大白菜A3连锁群23.67Mb-23.75Mb的区域内。本研究在CRb基因初步定位的基础上,利用图位克隆法对其进行分离克隆及功能鉴定。主要结果如下：1.CRb基因的精细定位及候选基因筛选：采用RCA法对CRb基因进行精细定位,共显性标记TCR79和TCR74筛选1142株F2感病个体,获得44株重组体,利用新开发的2个InDel标记和1个SSR标记,2个与TCR74共分离的共显性标记TCR30, TCR37以及1个显性标记TCR108对重组体进行基因型鉴定,最终将CRb基因定位于0.07cM的区域内。得到3个与CRb基因存在共分离关系的标记。通过序列信息比对确定了2个能够编码TIR-NBS-LRR类的抗病蛋白的基因CRbl和CRb2为候选基因。2.CRb候选基因的克隆与结构分析：利用改良RACE法对CRb候选基因进行克隆,分别获得3630bp的CRbl基因和3669bp的CRb2基因。NCBI conserve domain search预测2个候选基因的蛋白结构发现,2个基因均能编码TIR-NBS-LRR类蛋白。抗病基因与感病基因编码的蛋白结构对比结果表明,2个候选基因的蛋白结构在抗病与感病材料之间均存在差异。进一步确定这两个基因即为CRb候选基因。3.CRb候选基因表达分析：通过对接菌后抗病及感病材料的叶片,叶柄,下胚轴以及根系中候选基因CRbl和CRb2的表达情况进行分析,结果表明在这4个组织中候选基因均有表达,且相对表达量在抗病与感病材料之间存在差异。但是仅在根系中CRbl和CRb2相对表达量的变化趋势相对一致,在其他3个组织中相对表达量的变化不存在规律。4.CRb候选基因植物表达载体构建及功能鉴定：利用酶切法构建2个CRb候选基因的植物表达载体,农杆菌介导遗传转化拟南芥获得6个CRb1拟南芥转基因株系,12个CRb2拟南芥转基因株系。抗病性鉴定结果表明2个候选基因的转基因植株的病情指数均低于野生型拟南芥,进一步说明2个基因在大白菜抗根肿病过程中均会发挥作用。5.CRb1和CRb2的系统发育分析：通过对芸薹属不同材料中的候选基因进行扩增,结果表明CRb1和CRb2仅存在于A基因组当中。对这两个基因进行系统发育分析表明,19份抗病材料中的CRb1和CRb2基因均具有同源性,且CRbl在19份抗病材料中的同源性比CRb2在19份抗病材料中的同源性高,但抗病与感病材料之间的同源性,CRbl基因比CRb2基因要低。综上所述,本研究利用图位克隆法从CRb位点定位并克隆出2个TIR-NBS-LRR类抗病基因CRbl和CRb2；2个基因在抗感材料根系中的相对表达量存在差异,但调控水平一致；通过对转基因拟南芥植株进行抗病性鉴定表明,CRbl和CRb2基因在抗病过程中均能发挥作用；系统发育分析表明,这2个基因仅存在于芸薹属A基因组中,且2个基因在19份抗根肿病材料中的同源性均较高,推断这2个基因在抗病材料中相对保守,因此能够发挥抗根肿病的作用。
[Abstract]:Cruciferae root swelling is a worldwide disease caused by (Plasmodiophora brassicae Woron) infection of Brassica brassica, which seriously endangers the normal production of cruciferous crops. The CRb gene is located in the 23.67Mb-23.75Mb region of Chinese cabbage A3 linkage group. In this study, the CRb gene was isolated and cloned and its function was identified by map cloning. The main results are as follows: fine mapping of 1.CRb gene and screening of candidate genes: CRb gene was mapped by RCA method. 1142 F2 susceptible individuals were screened with codominant markers TCR79 and TCR74, and 44 recombinant strains were obtained. Two newly developed InDel markers and one SSR marker, two co-dominant marker TCR30, TCR37 and one dominant marker TCR108 were used to identify the genotype of the recombinant. Finally, the CRb gene was located in the region of 0.07cM. Three markers of cosegregation with CRb gene were obtained. Through sequence information alignment, two genes, CRbl and CRb2, which can encode TIR-NBS-LRR class disease resistance proteins were identified as candidate genes. The cloning and structure analysis of 2.CRb candidate genes were carried out. The modified RACE method was used to clone CRb candidate genes. The CRbl gene of 3630bp and the. NCBI conserve domain search of CRb2 gene of 3669bp were obtained to predict the protein structure of two candidate genes. Both genes can encode TIR-NBS-LRR protein. The results showed that the protein structures of the two candidate genes were different between disease-resistant and susceptible materials. 3.CRb candidate gene expression analysis: the expression of candidate genes CRbl and CRb2 in leaves, petioles, hypocotyls and roots of disease-resistant and susceptible materials were analyzed. The results showed that candidate genes were expressed in all of the four tissues, and the relative expression levels were different between disease-resistant and susceptible materials. However, the relative expression of CRbl and CRb2 in the root system showed the same trend. Construction and functional identification of 4.CRb candidate gene plant expression vector: two CRb candidate gene plant expression vectors were constructed by restriction endonuclease digestion. Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of Arabidopsis thaliana 6 CRb1 Arabidopsis transgenic lines and 12 CRb2 Arabidopsis transgenic lines were obtained. The disease index of transgenic plants with two candidate genes was lower than that of wild-type Arabidopsis thaliana. Phylogenetic analysis of 5.CRb1 and CRb2: by amplification of candidate genes in different materials of Brassica, the results showed that CRb1 and CRb2 existed only in A genome. Phylogenetic analysis of the two genes showed that both CRb1 and CRb2 genes were homologous in 19 resistant materials, and the homology of CRbl in 19 resistant materials was higher than that of CRb2 in 19 resistant materials. But the homology of CRbl gene was lower than that of CRb2 gene. In conclusion, two TIR-NBS-LRR resistance genes, CRbl and CRb2;, were mapped and cloned from CRb loci by map cloning. The relative expression levels of CRbl and CRb2; genes were different in the roots of the resistant materials, but the regulatory level was the same. The identification of resistance of transgenic Arabidopsis thaliana plants showed that both CRbl and CRb2 genes could play a role in the disease resistance, and phylogenetic analysis showed that the two genes existed only in the A genome of Brassica. The homology of two genes in 19 Rhizomegaly resistant materials was high. It was concluded that the two genes were relatively conserved in the resistant materials, so they could play the role of resistance to Rhizomegaly.
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.4

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本文编号：2287480