五种昆虫非编码RNA基因发现及miR-14的功能研究

发布时间：2018-11-05 06:51

【摘要】：非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA基因,主要包括小RNA(如miRNA等)和长的非编码RNA(lncRNA)。研究表明,miRNA和lncRNA具有重要的功能。本文预测了五种昆虫的非编码RNA基因,通过基因家族分析发现了昆虫特异性的miR-14,进行了靶标预测及双荧光素酶报告基因验证,以及miR-14和其靶标基因的表达分析,过表达或干扰miR-14的表达等实验表明,昆虫特异性miR-14靶向蜕皮激素合成代谢通路中的9个基因,明显增强了对通路的调控能力,在昆虫蜕皮完成后抑制蜕皮激素的合成,维持了家蚕发育的稳定性和一致性。主要工作如下:1、5种昆虫非编码RNA基因的发现及特征分析将褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱5个物种卵、幼虫、蛹、成虫等不同发育阶段的个体分别混合,提取RNA,经测序获得5个物种小RNA序列,过滤后获得五个物种Uniq reads信息。构建miRNA预测流程,分别在褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱的小RNA文库中发现了110、76、64、108、118个miRNA基因。收集褐飞虱低繁殖力雌成虫、高繁殖力雌成虫、低繁殖力五龄若虫、高繁殖力五龄若虫、Mudgo品系脂肪体、Taichung Native 1品系脂肪体、Mudgo品系唾液腺、Taichung Native1品系唾液腺、Izumo87品系、Chikugo89品系以及普通种群的转录组数据,构建了lncRNA预测流程,从12个转录组中共发现1,882个lncRNA基因。褐飞虱lncRNA主要为两个外显子的转录本,转录本长度显著短于蛋白质编码基因(841 bp vs 1106 bp,T-test,P0.01)。19%的褐飞虱lncRNA发生选择性剪切。繁殖力与致害性种群中均存在特异性表达的lncRNA,且发现3个lncRNA基因与繁殖力密切相关的蛋白质编码基因发生重叠,表明lncRNA可能参与调控褐飞虱的繁殖力。2、昆虫miRNA基因家族分析依据物种进化关系,选取了5种脊椎动物(人、小鼠、家鸡、非洲蟾蜍、斑马鱼)、17种昆虫(二化螟、黑腹果蝇、意大利蜜蜂、丽蝇蛹集金小蜂、冈比亚按蚊、致倦库蚊、埃及伊蚊、诗神袖蝶、烟草天蛾、家蚕、赤拟谷盗、豌豆蚜、褐飞虱、三化螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、灰飞虱)、水蚤、线虫和海蠕虫共25个物种的miRNA。基因家族分析发现,let-7、mir-1、mir-133等14个miRNA家族在所有物种中高度保守;bantam、mir-2、mir-263等9个miRNA家族在无脊椎动物中保守;mir-14、mir-277、mir-316、mir-932等为昆虫特异性miRNA基因家族,其序列在昆虫中高度保守。3、昆虫特异性miR-14基因对蜕皮激素通路的调控选择昆虫特异性的miR-14基因开展功能研究。收集了12种昆虫的miR-14基因序列以及3'UTR数据,利用RNAhybrid和miRanda两个软件预测靶标,结果表明miR-14在所有昆虫中靶向蜕皮激素通路中的多个基因。为进一步分析昆虫特异性的miR-14基因在变态发育中的调控功能,通过文献挖掘构建了昆虫蜕皮激素的上游调控通路、合成通路及下游应答通路(以下简称为昆虫蜕皮激素通路),靶标预测发现家蚕miR-14可作用于通路中的12个基因。考虑家蚕3'UTR数据丰富及实验操作方便等优点,利用双荧光素酶报告基因载体系统验证了预测靶标,分别将12个预测为靶标基因的3'UTR克隆进pMIR-REPORT载体,与miR-14的mimics共转染HEK293T细胞,测定荧光含量。同时,对靶标基因的3'UTR进行了突变,检测mimics的干扰效果是否有影响。结果表明,miR-14的mimics对携带有InR、Akt、Erk、Torso、Nvd、Shd、EcR、E74和等9个靶标基因3'UTR的载体荧光素酶活性具有明显的抑制作用,而当3'UTR的靶标位点被突变后,干扰作用消失。综合软件预测和靶标验证的结果,表明miR-14对昆虫蜕皮激素通路中的多个基因具有调控作用。分析认为,这种作用模式显著增强miR-14基因对蜕皮激素合成及其作用的调控能力。lnR、Akt、Erk、Torso分别位于诱导和刺激蜕皮激素合成的三条上游调控通路上,Nvd,Shd等位于蜕皮激素的合成通路上,EcR、E74、Brc,是蜕皮激素的受体及下游应答基因,通过对这9个基因的调控,miR-14可以成功地控制蜕皮激素的上游调控,合成及下游应答通路,实现对蜕皮激素的全面调控作用。4、miR-14及靶标基因的表达谱分析对家蚕头、前胸腺、中肠、马氏管和表皮五个组织进行了miR-14的表达分析。结果表明,两个miR-14成熟体(miR-14-5p和miR-14-3p)在五个组织中的表达量大致相似,miR-14为组成型表达的miRNA基因。对3龄第1天至蛹期第2天共18个样本进行了发育时期的表达分析,结果显示miR-14在龄期转换过程中呈规律性变化。miR-14-3p在每个龄期的第1天高表达,miR-14-5p在每个龄期的最后一天高表达。为更细致地研究miR-14的表达,对家蚕3龄第1天至4龄第1天每6h样共20个样本进行了表达量分析。结果表明,miR-14-5p于蜕皮前24h表达开始上升,蜕皮前12h表达量升至最高,其表达量变化与蜕皮激素合成具有密切的关系。在需要蜕皮激素的发育时间点上,miR-14基因表达量降低。而在不需要蜕皮激素的时间点上,miR-14表达明显升高。检测了InR、Ras、Spo、Shd、EcR、E74、Brc等靶标基因的表达情况,对3龄第1天至蛹期第2天共18个样本进行表达分析。结果表明,InR、Ras两个基因的表达无明显规律;E74基因在每个龄期最后一天高表达;Brc在蛹期高表达;Spo、Shd、EcR三个基因的表达趋势一致,在每个龄期蜕皮前2天高表达。分析了Spo在家蚕3龄第1天至4龄第1天每6h样本中的表达,发现Spo于蜕皮前30h左右表达量升至最高。Spo与Shd基因直接参与蜕皮激素的合成,EcR基因为蜕皮激素的受体基因,Spo、Shd、EcR三个基因的表达趋势与蜕皮激素滴度的变化趋势一致,与miR-14-5p的表达呈负相关。表达量分析结果,进一步证明了miR-14-5p对蜕皮激素通路的调控作用。5、过表达与干扰miR-14对家蚕变态发育的影响合成了miR-14的类似物agomir-14,注射3龄2天家蚕,过表达家蚕miR-14。定量PCR检测结果显示,在三个重复中,过表达24 h后的表达量分别上升了3倍、8倍和22倍,过表达48h后仍可维持高丰度。注射不同浓度的agomir-14-5p均可致家蚕蜕皮延迟,注射540pmol agomir-14-5p致大约10%的家蚕个体蜕皮延迟,注射1080 pmol agomir-14-5p导致大约60%的家蚕个体蜕皮延迟,而agomir-14-3p组蜕皮时间与NC接近,表明家蚕中主要以miR-14-5p起作用。合成了miR-14的抑制剂antagomir-14,注射3龄1天家蚕,干扰miR-14的表达。利用qRT-PCR检测干扰后24h和48h miR-14-5p的表达量,结果显示干扰后两个时间点miR-14-5p的表达量均下降,其中48h达到显著下降,表明注射antagomir-14达到了抑制miR-14表达的效果。antagomir-14-5p可致20-30%家蚕个体蜕皮延迟,而antagomir-14-3p蜕皮时间与NC接近。综合过表达与干扰实验结果,表明家蚕miR-14-5p通过调控蜕皮激素通路基因的表达,调控蜕皮激素的合成,进而影响家蚕的变态发育。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q963;S433

【参考文献】