HaPGRP-D基因在棉铃虫先天性免疫中的功能研究

发布时间：2018-12-24 15:51

【摘要】：肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)作为一类模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)特异性地识别肽聚糖(Petidoglycan, PGN),在先天性免疫反应中担任着至关重要的角色。本文以鳞翅目夜蛾科昆虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)为研究对象,克隆得到了一个PGRP基因,命名为HaPGRP-D,并对其在棉铃虫先天性免疫应答中的功能进行了研究。主要实验结果如下：1.HaPGRP-D基因的克隆及序列分析从棉铃虫血细胞转录组中鉴定到一个PGRP cDNA,将其命名为HaPGRP-D。 HaPGRP-D cDNA中包含了一个699 bp的ORF,编码232个氨基酸。经预测该基因编码的蛋白质具有一个信号肽序列(1-18 aa),一个PGRP结构域(38-181 aa)和一个Ami 2结构域(50-187 aa)。成熟蛋白的分子量(MW)为26.081 kDa,等电点(PI)为5.82。将HaPGRP-D与其他鳞翅目昆虫PGRP进行序列多重比对分析,结果显示HaPGRP-D的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PGRP具有较高的相似性。多重序列比对分析也显示T7溶菌酶Zn2+结合和酰胺酶活性所必需的五个氨基酸位点在HaPGRP-D中也是保守的,这表明HaPGRP-D可能是一种酰胺酶型PGRP。2.HaPGRP-D组织特异性表达分析利用RT-PCR检测HaPGRP-D在棉铃虫幼虫四种组织(脂肪体、血细胞、中肠和表皮)中的表达情况。结果表明HaPGRP-D基因在中肠高表达,在血细胞中低表达。表皮和脂肪体中未检测到HaPGRP-D基因的表达。3、细菌或凝胶珠诱导后血细胞中HaPGRP-D表达量的变化利用qRT-PCR检测注射细菌或凝胶珠后棉铃虫幼虫血细胞中HaPGRP-D表达量的变化。结果显示：注射革兰氏阴性(Gram-negative,G-)大肠杆菌(Escherichia coli)、革兰氏阳性(Gram-positive,G+)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或Sephadex DEAE A-25凝胶珠都能够诱导棉铃虫血细胞中HaPGRP-D基因表达量上调。4、重组蛋白原核表达和纯化扩增HaPGRP-D成熟肽cDNA(编码19-232 aa),并将其与pET-32a表达载体连接。将构建好的pET-32a-PGRP-D重组表达载体转入大肠杆菌BL21感受态细胞中,利用IPTG诱导rHaPGRP-D的表达。用High-Affinity Ni-NTA Resin纯化rHaPGRP-D。纯化出的rHaPGRP-D大小约40 kDa,与预期的分子量大小一致。5、HaPGRP-D蛋白体外活性分析利用获得的HaPGRP-D重组蛋白开展了以下蛋白体外活性分析实验：5.1与细菌的结合活性分析分析了rHaPGRP-D与E. coli和S. aureus这两种细菌的结合活性。结果表明HaPGRP-D能够直接结合到细菌表面,并且这种结合活性是Zn2+依赖型的。5.2凝集活性分析检测了rHaPGRP-D对E. coli和S. aureus这两种细菌的凝集活性。结果表明HaPGRP-D能够以Zn2+依赖型的方式凝集细菌。5.3酰胺酶活性分析用S. aureus的PGNs检测rHaPGRP-D的酰胺酶活性。实验结果显示在Zn2+存在时rHaPGRP-D能够强烈地降解PGNs,没有Zn2+存在时,rHaPGRP-D对PGNs的降解活性较弱。这一结果证明HaPGRP-D是一种Zn2+依赖的酰胺酶。5.4杀菌活性分析检测了rHaPGRP-D对E. coli和S. aureus的杀菌活性。结果表明无论有无Zn2+的存在,rHaPGRP-D都能够抑制E. coli的生长。只有、Zn2+存在时,rHaPGRP-D才能够抑制S. aureus的生长。这些结果表明HaPGRP-D具有杀菌活性。5.5 HaPGRP-D促进血细胞的吞噬作用利用体外吞噬实验检测HaPGRP-D是否参与吞噬作用。结果显示rHaPGRP-D实验组中血细胞对细菌的吞噬指数和吞噬率都极其显著的高于rTrx对照组。这一结果表明HaPGRP-D可能参与调控棉铃虫血细胞的吞噬作用。5.6 HaPGRP-D促进血细胞的包囊作用利用体外包囊实验检测HaPGRP-D是否参与包囊作用。结果显示rHaPGRP-D实验组中凝胶珠被血细胞包囊的包囊率极显著地高于对照组。这表明HaPGRP-D可能参与调控棉铃虫血细胞的包囊作用。5.7 HaPGRP-D与血细胞的结合分析利用免疫细胞化学的方法检测了rHaPGRP-D能否与棉铃虫血细胞结合。实验结果表明rHaPGRP-D能够结合到浆细胞和粒细胞的表面。综上所述,上述实验结果表明HaPGRP-D作为PRR、酰胺酶和调理素在棉铃虫的体液免疫和细胞免疫中起着非常重要的作用。
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【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433;Q78

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