加工番茄内生细菌种群动态及内生芽孢杆菌抑菌促生作用研究

发布时间：2018-12-26 10:33

【摘要】：为了明确新疆北疆主栽加工番茄品种不同部位内生细菌的种类及其种群动态,为筛选开发能有效防治加工番茄病害的生物防治菌剂提供菌种来源。从新疆北疆地区的第七师和第八师加工番茄主栽区采集不同品种的加工番茄植株样品,采用组织稀释培养法对加工番茄不同部位的组织进行了内生细菌的分离和计数,并采用常规形态特征、生理生化测定和分子生物学方法对分离获得的内生细菌进行了鉴定,明确了不同品种、地域加工番茄不同部位的内生细菌种群动态;采用平皿对km培养法对内生细菌拮抗性进行了评价和筛选,并采用常规鉴定方法结合分子生物学方法(16S r DNA和gry A基因序列分析)对2株高拮抗真菌活性的内生芽孢杆菌TEB-01和TEB-31进行了鉴定;同时通过脂肽抗生素相关基因PCR检测,RP-HPLC和MALDI-TOF-MS分析方法对2株拮抗内生细菌的抗菌脂肽抗生素种类进行了鉴定,对其抗菌脂肽稳定性进行了研究;最后对2株内生细菌的促生作用进行了评价,对其作用机制以及定殖模式进行了研究和分析。主要研究结果如下:1.初步确定了第七师和第八师加工番茄内生细菌的种群为6类,10个种,分别是假单胞菌(Pseudomonas sp.)、黄单胞菌(Xanthomonas sp.)、土壤杆菌(Aagrobacterium sp.)、欧文氏菌(Erwina sp.)、肠杆菌(Entenobacter sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.),其中Bacillus sp鉴定出5个种,分别为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis),解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。在分离得到的285株内生细菌中,芽孢杆菌(Bacillus sp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)是分离频率最高,数目最多,在加工番茄不同品种、不同器官中广泛分布且数量多,是加工番茄内生细菌的主要优势种群。2.不同种植地区、不同栽培品种、不同生育期加工番茄体内内生细菌的种群是有差异的。第七师种植区的加工番茄品种体内分离得到5个内生细菌种群,8个种类,在四个加工番茄品种中亨氏3402的内生细菌种类最少,有5种,其余三个品种石番35、石红303和里格尔87-5均为7种。第八师种植区采集的品种体内分离得到6个内生细菌种群,9个种类,里格尔87-5品种内生细菌的种类最多为9种,其余石番35和佳义6号均为7种。不同生育期里格尔87-5品种体内内生细菌的种群动态变化为:从苗期到开花期其体内内生细菌的种类不断增加,开花期、结果期和成熟期的种类保持稳定。3.就种群数量来说,加工番茄不同品种体内内生细菌种群数量都有差别,但其总体数量在104cfu/g fw;不同器官其种群数量也不同,但大体表现为根部最多,其次是茎、叶、果实最少。不同生育期,里格尔87-5品种体内内生细菌的数量从苗期到开花期增多,结果期到成熟期逐渐下降。4.成功筛选出2株均能对番茄早疫病菌、番茄枯萎病菌、棉花立枯丝核菌、棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌5种病原真菌有良好抑菌作用的内生拮抗菌株TEB-01和TEB-31。通过常规方法(培养和形态特征、生理生化测定)结合16S r DNA和gry A基因序列分析,将TEB-01菌株鉴定为莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis),TEB-31菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。5.通过脂肽抗生素相关基因PCR检测,RP-HPLC和MALDI-TOF-MS鉴定分析,莫海威芽孢杆菌TEB-01菌株可产生surfactin和fengycin两类脂肽抗生素,且存在C15-surfactin(1058.67和1074.61)、C16-fengycin A、C-17 fengycin A共4种同系物。解淀粉芽孢杆菌TEB-31菌株可产生Iturin A、mycosubtilin、surfactin和fengycin四类脂肽抗生素,且存在C15-iturin A、C15-surfaction、C18-mycosubtilin、C14-fengycin A、C15-fengycin A、C16-fengycin A、C17-fengycin A(或C15-fengycin B)、C16-fengycin 8种同系物。6.内生芽孢杆菌TEB-01和TEB-31菌株抗菌脂肽粗提液均能使5种病原真菌的菌丝发生形态的有害变化,多表现为菌丝扭曲、变形、内含物不均匀、形成泡囊结构甚至发生破裂现象。通过对抗菌脂肽理化特性研究发现,这两菌株抗菌脂肽粗提液均能耐酸碱和热、抗紫外线,对蛋白酶K不敏感,对胰蛋白酶相对较敏感。7.内生芽孢杆菌TEB-01和TEB-31菌株促生作用的研究结果发现,两菌株的无细胞滤液100倍稀释度对加工番茄和棉花种子根芽生长的促生效果最佳;发酵液不同浓度以106cfu/ml浸种对加工番茄和棉花幼苗的株高、鲜重、干重等生长指标的促生效果最佳;浸种、灌根、喷雾这三种接种方式中,喷雾接种与CK相比,对加工番茄和棉花幼苗没有促生作用,浸种和灌根接种对加工番茄和棉花幼苗的株高、鲜重和干重有一定的促生作用,但以浸种方法接种对加工番茄和棉花幼苗的促生效果最显著。8.内生芽孢杆菌TEB-01和TEB-31菌株促生机制的初步研究表明,这两菌株都可产生嗜铁素,还可以产生植物生长内源激素,TEB-01菌株可产生GA和IAA,TEB-31菌株可产生GA,它们通过产生植物生长激素可直接促进加工番茄的生长;此外TEB-01和TEB-31菌株还可通过适当浓度(106cfu/ml)浸种提高加工番茄的叶绿素含量和增强其根系还原强度,促进加工番茄的生长。9.利用GFP基因标记法,成功地将芽孢杆菌穿梭载体p GFP4412质粒导入芽孢杆菌TEB-01和TEB-31菌株中,通过针刺伤茎方式,将两个标记菌株接种到加工番茄茎基部,徒手纵切茎组织切片在荧光显微镜下观察,发现两个标记菌株可在加工番茄的茎组织中定殖。通过对加工番茄不同组织的标记菌株回收发现,这两个菌株能在加工番茄的根和茎组织中定殖。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S641.2;S476.1

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本文编号：2391969