棉铃虫甾醇载体蛋白-2的NMR结构及启动子转录活性研究

发布时间：2019-01-28 23:19

【摘要】：棉铃虫是常见的农业害虫,危害多种重要经济作物。杀虫剂的长期使用导致棉铃虫产生较强的抗药性和Bt抗虫棉耐受,因此迫切需要继续开发安全高效的生物杀虫剂。胆固醇运输蛋白2(SCP-2)是昆虫体内一种重要的非特异性固醇运输蛋白,为开发新型农药提供了优良的潜在靶点。本研究从两个方面展开,一方面运用NMR结构解析、分子对接、突变体功能测定等技术手段,在蛋白质水平上分析棉铃虫SCP-2蛋白的三维结构和重要的功能位点,为基于HaSCP-2蛋白结构快速筛选棉铃虫抑制剂提供条件。取得如下研究结果：(1)构建pGEX-KG-HaSCP-2融合表达载体,使用终浓度0.2raM IPTG在28℃条件下诱导表达10 h、通过GST亲和层析、Thrombin酶切、阴离子交换层析和分子筛柱分离,建立起HaSCP-2蛋白快速高效的表达纯化程序。(2)基于文献检索、蛋白质序列比对、MALDI-TOF质谱和NMR HSQC谱图分析等,对蛋白进行了截短优化。通过去除HaSCP-2蛋白N端16个氨基酸、C末端4个氨基酸,同时添加TritonX- 100分子,成功获得可用于NMR结构分析用蛋白样品。NBD-胆固醇结合测定表明截短优化后不改变蛋白和胆固醇的亲和能力。(3)基于NMR技术获得了HaSCP-2蛋白在溶液中的三维结构。结果显示HaSCP-2蛋白由5个α-螺旋和4个β-折叠组成,4个β-折叠位于一个平面上和处于该平面同侧的α-螺旋共同构成了包含入口和出口的内部空腔,为脂类分子结合和转运提供疏水性通道。结构比较发现该蛋白和兔源SCP-2蛋白的结构相似度最高,达到47%。HaSCP-2蛋白NMR结构数据已经上传PDB数据库,登录号为4UEI。(4)利用SYBYL-7.3进行蛋白和脂分子配体的柔性对接。对接结果显示Y51、F53、F89、I91、F110、I117、Q131等位点可能是蛋白和固醇分子的结合位点。通过蛋白点突变和NBD-胆固醇结合测定发现Y51A,Y51W、F53A、F53W、F89A、F110W、I117M、Q131A等突变体蛋白和胆固醇结合能力下降,I91M突变体溶解性较差未能成功纯化,表明这些位点可能是胆固醇和HaSCP-2蛋白结合时的相互作用位点。(5)分子对接显示抑制剂AeSCPI-1和mangostin可以和HaSCP-2蛋白结合。竞争性结合测定显示这两种抑制剂均可以抑制HaSCP-2和NBD-胆固醇的结合。另外生物测定也发现3龄幼虫饲喂这两种抑制剂后,虫体脂肪体内胆固醇含量发生显著下降。另一方面,本研究克隆和分析了调控棉铃虫SCP-2表达的SCPX/SCP-2基因启动子序列,为后期研究该基因表达调控机理打下重要基础。主要取得以下研究结果：(1)通过染色体步移,成功克隆了棉铃虫SCPX/SCP-2基因ORF区上游约8kb侧翼序列。(2)构建截短启动子/荧光素酶报告基因重组质粒,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定了启动子不同区域的活性,结果表明其中位于3’端1.8kb区域启动子最高,推测该区域对调控HaSCP-X/SCP-2基因表达非常重要。(3)通过5’-RACE分析,发现棉铃虫SCP-X/SCP-2基因启动子区存在多个转录起始位点,转录调控较为复杂。(4)HaSCPX/SCP-2启动子的生物信息学分析发现,该转录起始位点上游37nt区域可能存在CEBP、AP-1、TGIF等顺式作用元件,这些元件的突变造成启动子活性显著降低,推测其为调控SCP-2表达的重要元件。本研究基于NMR技术首次获得了鳞翅目昆虫棉铃虫SCP-2蛋白的三维结构,探讨了蛋白和胆固醇底物结合的功能位点,并克隆和分析了调控SCP-2表达的启动子序列。研究为利用该潜在靶位点开发新型高效杀虫剂提供了重要理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S433

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 毛希安,沈联芳,高原,倪嘉缵;用NMR双谱仪方法研究稀土离子的磁化率[J];波谱学杂志;1986年03期

2 吴立军,相婷,刘铁汉,李麦香,高之扬,孟祥兰;菖蒲醇酮立体结构的NMR研究[J];波谱学杂志;1998年03期

3 尚玉俊,赵天增,刘宏民,吴鸣建,傅经国,谢亚雄;苦皮藤水解产物中的β二氢沉香呋喃倍半萜多醇的NMR研究[J];波谱学杂志;2002年02期

4 崔万秋,邱建荣;Li_2O-B_2O_3-P_2O_5系统非晶态混合骨架效应的NMR研究[J];波谱学杂志;1987年01期

5 张殿坤,李玉桂,王国洪,缪方明,刘小兰;有机磷化合物的NMR研究——Ⅱ0,0—二烷基膦酸酯的~1H、~(13)C和~(31)PNMR谱[J];波谱学杂志;1988年02期

6 徐峻;多维NMR结构测定和解析中的模糊图论应用[J];波谱学杂志;1995年04期

7 乔爱新,赵新,李丽云,刘午阳;部分水解聚丙烯酰胺的NMR研究[J];新疆大学学报(自然科学版);2000年03期

8 江忝益,张志亮,杨宪斌,闵吉梅;8,2’-O-环化-9β-D-腺嘌呤阿拉伯糖苷的NMR及结构研究[J];波谱学杂志;1991年02期

9 晏欣,王德华,钱保功;聚合物侧基NMR弛豫相关函数[J];波谱学杂志;1990年02期

10 杨晓艳;吴香玉;安艳捧;唐惠儒;;吲哚丙酮酸的酮-烯醇互变异构化的NMR研究[J];波谱学杂志;2014年01期

相关会议论文 前10条

1 李勤;杨春晖;葛泽梅;李润涛;崔育新;;NMR确定一类新的氨基二硫代甲酸酯类化合物的结构[A];第十三届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2004年

2 章宪权;邬学文;潘麟章;吴肖令;田丰;;Na_2O-B_2O_3-V_2O_5系玻璃中~(11)B、~(51)V的NMR研究[A];第四届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];1986年

3 周子南;孝延文;高新风;景凤英;戴莹琨;吴盛容;;聚甲基丙烯酸乙酯链结构的NMR研究[A];第七届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];1992年

4 刘堂宴;傅容珊;肖立志;;球管孔隙模型的NMR弛豫特征的研究[A];中国地球物理.2003——中国地球物理学会第十九届年会论文集[C];2003年

5 陈铁红;韩文慧;孙平川;丁大同;;聚合物/无机纳米复合材料的固体NMR研究[A];2003年纳米和表面科学与技术全国会议论文摘要集[C];2003年

6 孙平川;;聚合物/无机纳米复合材料的固体NMR研究[A];第十二届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2002年

7 刘思敏;吴晓军;程功臻;;新型含二苯基甘脲单元的氮杂大环NMR[A];第十三届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2004年

8 周波;陈志华;戴静秋;贾志胜;杨立;刘中立;;绿茶中两种新的没食子酸类衍生物的2D NMR研究[A];第十一届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2000年

9 石和平;;固态聚合物中增塑剂的~1H NMR直接测量[A];第四届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];1986年

10 吴达旭;施继成;卢葛覃;康北笙;;含手性膦配体的铑化合物的NMR研究[A];第九届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];1996年

相关博士学位论文 前5条

1 万钱芬;T-2毒素影响动物代谢组的NMR研究[D];中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所);2015年

2 马海昊;棉铃虫甾醇载体蛋白-2的NMR结构及启动子转录活性研究[D];华中师范大学;2016年

3 张利民;几种高分子材料的域结构、分子动力学和相互作用的固体NMR研究[D];中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所）;2007年

4 刘爱红;表面活性剂及水溶性功能高分子的NMR研究[D];中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所）;2007年

5 曹琛_g;缬沙坦与类膜介质的相互作用及1型血管紧张素Ⅱ受体的NMR研究[D];华中科技大学;2012年

相关硕士学位论文 前10条

1 王凯强;基于脂肪酸及~1H-NMR特征标志物的有机猪肉溯源技术研究[D];中国农业科学院;2015年

2 邹友龙;沉积岩石重构及孔隙尺度NMR响应模拟[D];中国地质大学(北京);2013年

3 刘岩;基于~1H NMR代谢组学方法研究敌敌畏对金鱼的毒性及作用机制[D];南京理工大学;2016年

4 常付彬;NMR测井仪传感器分析及其噪声匹配研究[D];华中科技大学;2011年

5 唐冰雯;基于NMR的代谢组学对甘遂毒性机制的研究[D];广东药学院;2012年

6 李俊健;基于NMR的代谢组学对甘遂甘草配伍减毒机制的研究[D];广东药学院;2014年

7 闫秀玲;聚合物辐照效应的NMR研究[D];新疆大学;2005年

8 季丹红;双过氧钒化合物与吡啶类配体相互作用的NMR研究[D];湖南科技大学;2012年

9 程一鑫;超声波对高甲氧基果胶NMR转折点蔗糖浓度及其结构的影响[D];南昌大学;2014年

10 王琳琳;聚合物弛豫行为的NMR研究[D];新疆大学;2010年

，

本文编号：2417410