毕赤酵母异源表达玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶及其酶学特性与功能的研究

发布时间：2019-03-18 17:50

【摘要】：玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae),以它的无性型孢子禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)而著名,它是一种植物病原菌,能够引起大规模毁灭性的作物疾病,如小麦、大麦的赤霉病和玉米的穗腐病等。在感染赤霉病的小麦和感染穗腐病的玉米细胞内,赤霉病原菌可以产生两种霉菌毒素,引起消化道反应、肝损伤和家畜生殖缺陷,严重危害人类健康。在菌丝体渗透过程中,赤霉菌体会产生细胞壁溶解酶,其中包括β-葡聚糖。人们认为,β-葡聚糖酶作为一种细胞壁修饰酶能够很好地分解β-葡聚糖和其他多糖组分,使其更容易降解,开始得到人类的广泛关注。内切-β-1,4-葡聚糖酶在纤维素的水解过程中起着非常关键的作用,它能够作用于纤维素链内的β-1,4糖苷键,将长链纤维素分子水解成更小分子量的葡萄糖聚合物。在原核生物和真核生物中,纤维素酶已经形成一个大的家族体系并表现出不同的特性。在本实验中,根据NCBI数据库公布的玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的基因序列(Genbank编号为ESU17701),根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行结构优化,通过PTDS方法合成了适合于在甲醇毕赤酵母系统内表达的玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶(Gzegl AI)基因,并将载有目的基因的酵母表达载体YR1730,电击转化入甲醇型毕赤酵母GS115菌株体内进行分泌表达,通过后期的活性鉴定、SDS-PAGE电泳等方法,获得能够表达玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的阳性酵母菌株。将获得的阳性毕赤酵母重组菌株进行扩大培养和诱导表达,获得重组β-1,4-葡聚糖酶,粗酶液经镍柱纯化后,进行相关酶学特性和动力学参数等的实验研究。结果表明:Gzegl AI的相对分子大小为27.17 k Da,蛋白定量为12.37μg/m L,等电点为7.75。酶的最适温度是40o C,最适p H为4.5;当把酶Gzegl AI置于4o C,24 h处理后,其在酸性p H下表现出一定的稳定性,特别是在p H 4.0-6.5的活性高于80%;研究温度稳定性时,把酶液在不同温度下处理不同时间显示,在50o C时处理半小时可保持初始酶活的30%,而当温度达到60oC时酶活急速下降,最终完全失活为零,所以此酶的热稳定性较差,并不耐高温;本实验还探究了高低(1 m M和10 m M)两种浓度的不同金属离子对酶活性的影响,研究发现低浓度的Mn2+、高浓度的Mn2+和Cu2+对酶活有抑制作用,Cu2+抑制力较强,而高浓度的Al3+却极大程度地促进了该酶活反应;选取羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、脱脂棉、滤纸和结晶纤维素(6%)等不同纤维素类物质进行底物特异性的反应研究,结果显示该酶对底物羧甲基纤维素钠有较强的专一性,其Km值为73.92 g/L,Vm值为0.16 g/(L.min);同时也研究了两种蛋白消化酶如胃蛋白酶(pepsin)和胰蛋白酶(trypsin)对Gzegl AI活性的影响,结果显示胃蛋白酶对酶活性有一定程度的抑制作用,相反地,胰蛋白酶却对酶促反应无任何研究影响。根据SWISS-MODEL网站的PDB数据库资源比对分析,选取4h7m.1.A(Th EG3)为模板进行同源性建模,两者相似度高达58.72%;同时发现,此β-1,4-葡聚糖酶属于糖基水解酶第12家族中,其三个催化残基Asp120、Glu137和Glu221在进化中是严格保守的。鉴于目前缺乏玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的相关报道,本实验通过毕赤酵母分泌表达玉蜀黍赤霉菌的β-1,4-葡聚糖酶基因,研究该β-1,4-葡聚糖酶的酶学性质与功能,不仅为阐述β-1,4-葡聚糖酶在玉蜀黍赤霉菌发育进程及致病机理中所起的作用提供理论依据,并且为玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶高效工程菌株的构建和工业化生产提供了一种潜在的应用选择。
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【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.4

【参考文献】