连作地黄根际土壤中固氮耐酚酸细菌的分离鉴定
发布时间：2019-07-11 17:26
【摘要】：以连作地黄根际土壤中的微生物为对象,筛选既能够固氮又能够耐受酚酸类物质的细菌,并对其进行鉴定,为克服连作障碍的菌剂开发提供菌种资源。通过阿须贝无氮培养基平板涂布及分离纯化试验,最终获得菌落形态特征鲜明的2株固氮菌:7号菌菌落湿润、边缘光滑、个体较大,橘黄色;12号菌菌落边缘光滑、个体较小,乳白色。耐酚酸试验结果显示,在125、250 mg/L对羟基苯甲酸浓度下,7号菌液的D_(600 nm)分别是对照组的2.78、1.93倍,12号菌液的D_(600 nm)分别是对照组的3.66、4.66倍,因此,2株固氮菌能有效耐受一定浓度的对羟基苯甲酸。生理生化分析结果显示,2株菌均具备水解淀粉、分解丙酮酸和产生吲哚的能力。16S rRNA测序及遗传进化分析结果显示,7号菌、12号菌分别与芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、假单胞菌属的地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)聚到一起,相似度均高于99%。
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图片说明： 测定不同试管中菌液的D600nm，评估菌株的耐受能力。1．416SrＲNA测序及分析参考文献［10］中的做法，提取纯化菌株的DNA。采用16SrＲNA通用引物27F:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，1492Ｒ:5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'进行PCＲ扩增［11］。将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用Blast将所得16SrＲNA基因序列与EzBio-Cloud数据库中的序列进行比对分析。通过MEGA4．1软件，应用邻近(NJ)法构建系统进化树，确定所得菌株的分类地位。2结果与分析2．1固氮菌的分离与纯化土壤样品经梯度稀释并涂布于阿须贝无氮培养基上培养3d后，可看到有多个菌落产生。挑取平板上长势良好的18个菌落进行克隆，进行多次划线分离纯化，进一步筛选得到2株菌落形态特征鲜明的固氮菌，编号是7号和12号。其中，7号菌形成湿润、边缘光滑、较大的橘黄色菌落;12号菌形成边缘光滑、较小的乳白色菌落。2．22株固氮菌的酚酸耐受能力对羟基苯甲酸是酚酸类物质的代表之一。为了检测2株固氮菌的酚酸耐受能力，将2株菌分别接入加有不同浓度对羟基苯甲酸的阿须贝液体培养基中，4d后测定菌液D600nm。如图1所示，在125、250mg/L对羟基苯甲酸浓度下，2株固氮菌生长速度均高于对照组(0mg/L)，7号菌液的D600nm分别是对照组的2．78、1．93倍，12号菌液的D600nm分别是对照组的3．66、4．66倍，且7号菌在125mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好，而12号菌在250mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好。进一步分析发现，这2株菌在500mg/L酚酸培养基中的生长速度均低于对照组。这些结果表明，在一定浓度范围内，对羟基苯甲酸能够促进这2株菌生长繁殖，，但是，过高浓度的对羟基苯甲酸会对这2株菌的生长繁殖造成一定程度的抑制作用。已
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图片说明： 测定不同试管中菌液的D600nm，评估菌株的耐受能力。1．416SrＲNA测序及分析参考文献［10］中的做法，提取纯化菌株的DNA。采用16SrＲNA通用引物27F:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，1492Ｒ:5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'进行PCＲ扩增［11］。将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用Blast将所得16SrＲNA基因序列与EzBio-Cloud数据库中的序列进行比对分析。通过MEGA4．1软件，应用邻近(NJ)法构建系统进化树，确定所得菌株的分类地位。2结果与分析2．1固氮菌的分离与纯化土壤样品经梯度稀释并涂布于阿须贝无氮培养基上培养3d后，可看到有多个菌落产生。挑取平板上长势良好的18个菌落进行克隆，进行多次划线分离纯化，进一步筛选得到2株菌落形态特征鲜明的固氮菌，编号是7号和12号。其中，7号菌形成湿润、边缘光滑、较大的橘黄色菌落;12号菌形成边缘光滑、较小的乳白色菌落。2．22株固氮菌的酚酸耐受能力对羟基苯甲酸是酚酸类物质的代表之一。为了检测2株固氮菌的酚酸耐受能力，将2株菌分别接入加有不同浓度对羟基苯甲酸的阿须贝液体培养基中，4d后测定菌液D600nm。如图1所示，在125、250mg/L对羟基苯甲酸浓度下，2株固氮菌生长速度均高于对照组(0mg/L)，7号菌液的D600nm分别是对照组的2．78、1．93倍，12号菌液的D600nm分别是对照组的3．66、4．66倍，且7号菌在125mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好，而12号菌在250mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好。进一步分析发现，这2株菌在500mg/L酚酸培养基中的生长速度均低于对照组。这些结果表明，在一定浓度范围内，对羟基苯甲酸能够促进这2株菌生长繁殖，但是，过高浓度的对羟基苯甲酸会对这2株菌的生长繁殖造成一定程度的抑制作用。已
【作者单位】： 河南师范大学生命科学学院;资源微生物与功能分子河南省高校重点实验室培育基地;
【基金】：国家自然科学基金(编号:21277041、21477035) 河南省高等学校重点科研项目(编号:15A180016)
【分类号】：S154.3
本文编号：2513335
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图片说明： 测定不同试管中菌液的D600nm，评估菌株的耐受能力。1．416SrＲNA测序及分析参考文献［10］中的做法，提取纯化菌株的DNA。采用16SrＲNA通用引物27F:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，1492Ｒ:5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'进行PCＲ扩增［11］。将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用Blast将所得16SrＲNA基因序列与EzBio-Cloud数据库中的序列进行比对分析。通过MEGA4．1软件，应用邻近(NJ)法构建系统进化树，确定所得菌株的分类地位。2结果与分析2．1固氮菌的分离与纯化土壤样品经梯度稀释并涂布于阿须贝无氮培养基上培养3d后，可看到有多个菌落产生。挑取平板上长势良好的18个菌落进行克隆，进行多次划线分离纯化，进一步筛选得到2株菌落形态特征鲜明的固氮菌，编号是7号和12号。其中，7号菌形成湿润、边缘光滑、较大的橘黄色菌落;12号菌形成边缘光滑、较小的乳白色菌落。2．22株固氮菌的酚酸耐受能力对羟基苯甲酸是酚酸类物质的代表之一。为了检测2株固氮菌的酚酸耐受能力，将2株菌分别接入加有不同浓度对羟基苯甲酸的阿须贝液体培养基中，4d后测定菌液D600nm。如图1所示，在125、250mg/L对羟基苯甲酸浓度下，2株固氮菌生长速度均高于对照组(0mg/L)，7号菌液的D600nm分别是对照组的2．78、1．93倍，12号菌液的D600nm分别是对照组的3．66、4．66倍，且7号菌在125mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好，而12号菌在250mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好。进一步分析发现，这2株菌在500mg/L酚酸培养基中的生长速度均低于对照组。这些结果表明，在一定浓度范围内，对羟基苯甲酸能够促进这2株菌生长繁殖，，但是，过高浓度的对羟基苯甲酸会对这2株菌的生长繁殖造成一定程度的抑制作用。已
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图片说明： 测定不同试管中菌液的D600nm，评估菌株的耐受能力。1．416SrＲNA测序及分析参考文献［10］中的做法，提取纯化菌株的DNA。采用16SrＲNA通用引物27F:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，1492Ｒ:5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'进行PCＲ扩增［11］。将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用Blast将所得16SrＲNA基因序列与EzBio-Cloud数据库中的序列进行比对分析。通过MEGA4．1软件，应用邻近(NJ)法构建系统进化树，确定所得菌株的分类地位。2结果与分析2．1固氮菌的分离与纯化土壤样品经梯度稀释并涂布于阿须贝无氮培养基上培养3d后，可看到有多个菌落产生。挑取平板上长势良好的18个菌落进行克隆，进行多次划线分离纯化，进一步筛选得到2株菌落形态特征鲜明的固氮菌，编号是7号和12号。其中，7号菌形成湿润、边缘光滑、较大的橘黄色菌落;12号菌形成边缘光滑、较小的乳白色菌落。2．22株固氮菌的酚酸耐受能力对羟基苯甲酸是酚酸类物质的代表之一。为了检测2株固氮菌的酚酸耐受能力，将2株菌分别接入加有不同浓度对羟基苯甲酸的阿须贝液体培养基中，4d后测定菌液D600nm。如图1所示，在125、250mg/L对羟基苯甲酸浓度下，2株固氮菌生长速度均高于对照组(0mg/L)，7号菌液的D600nm分别是对照组的2．78、1．93倍，12号菌液的D600nm分别是对照组的3．66、4．66倍，且7号菌在125mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好，而12号菌在250mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好。进一步分析发现，这2株菌在500mg/L酚酸培养基中的生长速度均低于对照组。这些结果表明，在一定浓度范围内，对羟基苯甲酸能够促进这2株菌生长繁殖，但是，过高浓度的对羟基苯甲酸会对这2株菌的生长繁殖造成一定程度的抑制作用。已
【作者单位】： 河南师范大学生命科学学院;资源微生物与功能分子河南省高校重点实验室培育基地;
【基金】：国家自然科学基金(编号:21277041、21477035) 河南省高等学校重点科研项目(编号:15A180016)
【分类号】：S154.3
本文编号：2513335
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