内生细菌Pantoea ananatis Sd-1降解水稻秸秆性能与漆酶催化性质的研究

发布时间：2019-08-30 10:22

【摘要】：我国水稻秸秆资源丰富,但由于其难降解的特征,限制了其开发利用。利用微生物资源实现对水稻秸秆资源的降解研究,已日趋成为国内外学者关注的热点。Pantoea ananatis Sd-1是本实验室分离得到的一株具有高效降解水稻秸秆能力的水稻内生细菌,为了进一步探索Sd-1降解水稻秸秆的条件及其对木质纤维素材料的降解机理,本文主要开展了以下三部分的研究。(1)最佳条件探索与成分分析利用水稻秸秆为唯一碳源,通过单因素实验与三因素三水平的正交优化实验得到了Sd-1降解水稻秸秆的最佳组合条件为接种量1.5%、pH10、秸秆含量2.5%,在该条件下,Sd-1对秸秆的降解率为46%。以预处理水稻秸秆为唯一碳源,连续6天研究了Sd-1对预处理水稻秸秆的降解率,在第3天达到最大值61.8%。通过GC-MS分析预处理秸秆降解后发酵液的成分,鉴定出了一些构成木质素的低分子苯化合物(如苯酚、苯乙酸等)以及一些酸类物质。(2)酶活变化与降解能力的研究定性培养基检测,确定了Sd-1具有分泌过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶的能力。以预处理秸秆为唯一碳源,连续6天检测了上述四种木质纤维素降解酶在秸秆降解过程中的活性变化,发现Sd-1产木质素过氧化物酶、漆酶和纤维素酶的活性均在第3天达到最大值,分别为5.9 U/mL、600 U/L和295 U/mL,而产生的半纤维素酶在第一天即达到最大值1345 U/mL。通过对预处理秸秆中的木质纤维素组分含量的测定,发现Sd-1对秸秆中的木质素、纤维素和半纤维素的降解率在第六天分别达到了35.62%、78.8%和75.2%。(3)漆酶的克隆与纯化通过对Sd-1全基因组的生物信息学分析,发现四段CDS序列(lac1-lac4)可能编码漆酶。进一步的进化树分析、同源序列分析与三维结构分析,确定Lac4为典型的细菌漆酶。对Lac4进行克隆与原核表达,SDS-PAGE显示其分子量约为60 kDa,Lac4酶活在以ABTS为底物时的最佳pH为2.5,在愈创木酚为底物时的pH为4.5。Lac4具有极度耐酸性,金属离子稳定性且受到Fe2+与Cu2+显著促进。Lac4具有氧化非酚型(ABTS)和酚型(愈创木酚)化合物的能力,对ABTS的亲和性Km值达到1.03±0.154 mM。Lac4具有使染料脱色能力,尤其是能快速有效使刚果红脱色,在有介质ABTS的存在下,其脱色率可达89%;Lac4在体外试验中能使木质素的降解率达到38%,通过GC-MS分析Lac4降解木质素后的产物,发现了一些小分子的苯环化合物如苯酚、邻苯二甲醛、苯二酚、苯乙酸等,进一步说明Lac4具有降解木质素成小分子物质的能力。另外通过定量PCR检测Lac4在预处理水稻秸秆培养基中的表达水平,其结果说明Lac4的表达受到木质纤维素的诱导。
【图文】：

示意图,过氧化氢氧化,催化过程,电子传递

内生细菌 Pantoea ananatis Sd-1 降解水稻秸秆性能与漆酶催化性质的研究赖 Fe3+和 Fe4+，通过多步的电子传递和形成一些中间自由基（如苯氧基和二甲氧基苄醇基离子）氧化底物，这些中间自由基能够承受非酶促氧化反应，如自由基的偶联聚合作用、侧链的切除、脱甲基作用和内部分子的叠加与重排[21]。木质素过氧化物酶不同于其他的过氧化物酶（如锰过氧化物酶），木质素过氧化物酶具有氧化非酚型芳香化合物的能力，在氧化的过程中不需要介质的参加，因为木质素过氧化物酶本身就具有很高氧化还原电势, LiP 的氧化还原电势可以达到 1.4 V[21-22]。木质素过氧化物酶的晶体结构显示其催化氧化活性中心血红素基团被埋在蛋白质的内部，必须通过一个通道才能进入外部的媒介发挥作用，尽管通道的大小不足以让大分子聚合物木质素与埋在木质素过氧化物酶内部的血红素基团连接，但是一些小的分子基团可以找到适合的分子结合位点[23]。木质素过氧化物酶催化作用过程中的电子循环图如图 1.2 所示[24-25]。

示意图,氧化催化,过氧化物酶,电子传递

图 1.3 MnP 依赖过氧化氢和金属离子氧化催化过程中的电子传递循环示意图[24]1.3.5 多样过氧化物酶 (Versatile peroxidases)多样过氧化物酶 (EC 1.11.1.16) 也是一种含有血红素的木质素降解过氧化物酶，具有结合木质过氧化物酶和锰过氧化物酶的混合型分子结构。多样过氧化物酶分子量在35~40 kDa 之间，等电点为 3.7[32-33]。多样过氧化物酶首次在白腐真菌 Pleurotus eryngii[34]中报道。随后，越来越多的多样过氧化物酶在其他的担子菌中被发现，Bjerkanderafumosa[35]和 Pleurotus pulmonarius[36]均报道具有产生多样过氧化物酶的能力。多样过氧化物酶同时具有木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的催化活性，，能够氧化 Mn2+，形成 Mn3+，催化藜芦醇、染料和酚型与非酚型的芳香化合物[24]。多样过氧化物酶的催化机制是结合 LiP 与 MnP 的催化电子传递循环机制[37]。但是这种酶的催化机制不同于典型的锰过氧化物酶，在催化的过程中，多样过氧化物酶是不依赖 Mn2+，氧化结构简单的胺类物质和酚型单体物质[34]。在木质素降解的过氧化物酶中，多样过氧化物酶由于其催化的多样性，包括多样过氧化物酶也不同于其他过氧化物酶，它能直接氧化底物，因此在工业生物技术上的应用具有很大的吸引力。但是多样过
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S38;S182

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