棉蚜P450 CYP6CY3的克
发布时间：2019-09-21 22:28
【摘要】：【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii)P450 CYP6CY3,将其开放阅读框(ORF)在原核细胞中进行表达,纯化融合蛋白,多次免疫小鼠获得CYP6CY3多克隆抗体,为进一步分析CYP6CY3在棉蚜不同组织部位的分布及其在抗性中的作用打下基础。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的ORF,并对其进行生物信息学及系统进化分析。构建重组质粒pET32a-CYP6CY3,转化大肠杆菌transetta(DE3)进行原核表达,利用切胶回收法获得纯化的融合蛋白,继而用纯化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制备鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗体;ELISA检测鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗体的效价,并通过Western blot及免疫组化检测该抗体特异性。【结果】棉蚜CYP6CY3 ORF长1 266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量为48.8 k D,理论等电点为8.99,不含有信号肽序列,属亲水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5个P450家族的特征基序。通过NCBI Blastx进行同源序列的比对分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,达到81%,与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性为79%,与桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性为76%,4种蚜虫的氨基酸序列都含有位于螺旋K中参与稳定核心结构的E××R完全保守序列及P450基因标志性的F××G×××C×G(358—367)血红素结合位点的共有序列。使用MEGA5软件构建系统进化树,显示棉蚜、豌豆长管蚜、麦双尾蚜及桃蚜聚为一类,亲缘关系较近。通过原核表达得到的CYP6CY3融合蛋白的相对分子量约为66 k D,基于纯化的CYP6CY3重组蛋白多次免疫昆明白小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测获得的鼠抗CYP6CY3抗体效价达到1㑳409 600。Western blot和免疫组化进一步证实,该抗体既能与异源表达的CYP6CY3蛋白特异性结合,也能与棉蚜组织中存在的天然CYP6CY3蛋白特异性结合,具有较好的免疫反应特异性。【结论】利用3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的开放阅读框,并用异源表达的蛋白免疫昆明白小鼠制备了高滴度、特异性强的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗体,可用于进一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗药性方面的作用。
【图文】：
7期魏原杰等：棉蚜P450CYP6CY3的克垄原核表达及多克隆抗体的制备1355200010007505002501002000100075050025010020001000750500250100bpbpbpM1M--2M3--ABCA：CYP6CY3部分序列PCR产物PartialsequencePCRproductofCYP6CY3；M：DNAMarker；1：PCR产物PCRproduct。B：3′-RACE产物3′-RACEproduct；2：第1轮PCR产物稀释100倍作为第2轮的模板扩增得到的PCR产物PCRproductwas100timesdilutedandthentakenasthetemplateofthelaterPCR。C：ORF扩增AmplificationoftheORF；3：PCR产物PCRproduct；--：阴性对照Negativecontrol图1棉蚜CYP6CY3扩增Fig.1AmplificationofCYP6CY3fromA.gossypii1176261515122676301101376126451151526176601201676226751251826276901301976326105135111263761201401方框内为起始和终止密码子Insidetheboxforthestartandstopcodons；CYP6CY3蛋白保守结构域：W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G用下划线标出CYP6CY3conservedmotifsincludingW×××R,AG××T,E××R,P××F×PE/DRTandF××G×××C×Gwereunderlinedinbold图2棉蚜CYP6CY3的开放阅读框核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig.2ORFsequenceandthededucedaminoacidsequenceofCYP6CY3fromA.gossypii无信号肽序列（图3-A），ProtScale分析平均疏水性指数为-0.192，属亲水性蛋白（图3-B）。通过NCBIBlastx进行同源序列的比对分析，结果显示，棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜
鹗敲舾衅废档?4、59倍[20]，这与石绪根[11]的研究结果一致，进一步说明了该基因在禾谷缢管蚜及棉蚜对吡虫啉产生抗性中具有重要作用。1701301007055403525M1BabkDA100μm100μmA：多克隆抗体与融合蛋白His-CYP6CY3Westernblot鉴定PolyclonalantibodycombinedwithHis-CYP6CY3fusionproteinspecificityofdetectionWesternblot；M：蛋白MarkerProteinMarker；1：融合蛋白Fusionprotein。B：免疫组化Immunohistochemistry；a：免疫前血清Pre-immuneserum；b：免疫后血清Afterimmunizationserum图8多克隆抗体与CYP6CY3特异性结合的检测Fig.8DetectionofpolyclonalantibodyspecificitybindingtoCYP6CY3随着分子生物学和DNA重组技术的发展，对于P450的异源表达系统常用的有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统以及哺乳动物细胞表达系统[21]。大肠杆菌表达系统是目前最常用的异源蛋白表达系统，具有表达水平高，技术要求低等优点，但其不能够进行翻译后修饰表达出的大部分真核蛋白不具有生物活性[21]。目前已有的报道使用大肠杆菌表达系统表达的昆虫细胞色素P450酶基因有棉铃虫CYP6B7[22]和CYP6B6[23]以及微小按蚊CYP6AA3[24]，，褐飞虱CYP4C62[25]等基因。笔者研究组前期已经成功在原核表达系统中表达了棉铃虫的CYP6B6蛋白，并制备得到了特异性好效价高的多克隆抗体[12,23]。所以在本研究中通过3′-RACE克隆得到了CYP6CY3ORF，然后利用原核表达系统诱导并纯化了CYP6CY3融合蛋白。His-CYP6CY3为包涵体蛋白，不具备生物活性，而制备多克隆抗体不需要得到其具有生物活性的蛋白，并且包涵体表达量大，可以纯化得到大量目的蛋白[12]。采用切胶回收的方法纯化包涵体蛋
【作者单位】： 新疆大学生命科学与技术学院/生物资源与基因工程重点实验室;新疆农业科学院农作物品种资源研究所;
【基金】：国家自然科学基金-新疆联合基金(U1603331) 新疆自治区青年科技创新人才培养工程(qn2015yx001)
【分类号】：S433.39
本文编号：2539588
【图文】：
7期魏原杰等：棉蚜P450CYP6CY3的克垄原核表达及多克隆抗体的制备1355200010007505002501002000100075050025010020001000750500250100bpbpbpM1M--2M3--ABCA：CYP6CY3部分序列PCR产物PartialsequencePCRproductofCYP6CY3；M：DNAMarker；1：PCR产物PCRproduct。B：3′-RACE产物3′-RACEproduct；2：第1轮PCR产物稀释100倍作为第2轮的模板扩增得到的PCR产物PCRproductwas100timesdilutedandthentakenasthetemplateofthelaterPCR。C：ORF扩增AmplificationoftheORF；3：PCR产物PCRproduct；--：阴性对照Negativecontrol图1棉蚜CYP6CY3扩增Fig.1AmplificationofCYP6CY3fromA.gossypii1176261515122676301101376126451151526176601201676226751251826276901301976326105135111263761201401方框内为起始和终止密码子Insidetheboxforthestartandstopcodons；CYP6CY3蛋白保守结构域：W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G用下划线标出CYP6CY3conservedmotifsincludingW×××R,AG××T,E××R,P××F×PE/DRTandF××G×××C×Gwereunderlinedinbold图2棉蚜CYP6CY3的开放阅读框核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig.2ORFsequenceandthededucedaminoacidsequenceofCYP6CY3fromA.gossypii无信号肽序列（图3-A），ProtScale分析平均疏水性指数为-0.192，属亲水性蛋白（图3-B）。通过NCBIBlastx进行同源序列的比对分析，结果显示，棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜
鹗敲舾衅废档?4、59倍[20]，这与石绪根[11]的研究结果一致，进一步说明了该基因在禾谷缢管蚜及棉蚜对吡虫啉产生抗性中具有重要作用。1701301007055403525M1BabkDA100μm100μmA：多克隆抗体与融合蛋白His-CYP6CY3Westernblot鉴定PolyclonalantibodycombinedwithHis-CYP6CY3fusionproteinspecificityofdetectionWesternblot；M：蛋白MarkerProteinMarker；1：融合蛋白Fusionprotein。B：免疫组化Immunohistochemistry；a：免疫前血清Pre-immuneserum；b：免疫后血清Afterimmunizationserum图8多克隆抗体与CYP6CY3特异性结合的检测Fig.8DetectionofpolyclonalantibodyspecificitybindingtoCYP6CY3随着分子生物学和DNA重组技术的发展，对于P450的异源表达系统常用的有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统以及哺乳动物细胞表达系统[21]。大肠杆菌表达系统是目前最常用的异源蛋白表达系统，具有表达水平高，技术要求低等优点，但其不能够进行翻译后修饰表达出的大部分真核蛋白不具有生物活性[21]。目前已有的报道使用大肠杆菌表达系统表达的昆虫细胞色素P450酶基因有棉铃虫CYP6B7[22]和CYP6B6[23]以及微小按蚊CYP6AA3[24]，，褐飞虱CYP4C62[25]等基因。笔者研究组前期已经成功在原核表达系统中表达了棉铃虫的CYP6B6蛋白，并制备得到了特异性好效价高的多克隆抗体[12,23]。所以在本研究中通过3′-RACE克隆得到了CYP6CY3ORF，然后利用原核表达系统诱导并纯化了CYP6CY3融合蛋白。His-CYP6CY3为包涵体蛋白，不具备生物活性，而制备多克隆抗体不需要得到其具有生物活性的蛋白，并且包涵体表达量大，可以纯化得到大量目的蛋白[12]。采用切胶回收的方法纯化包涵体蛋
【作者单位】： 新疆大学生命科学与技术学院/生物资源与基因工程重点实验室;新疆农业科学院农作物品种资源研究所;
【基金】：国家自然科学基金-新疆联合基金(U1603331) 新疆自治区青年科技创新人才培养工程(qn2015yx001)
【分类号】：S433.39
本文编号：2539588
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