四种蝗虫线粒体基因组测定及直翅目系统发生分析

发布时间：2019-10-10 07:51

【摘要】：本研究采用Long-PCR和sub-PCR相结合的方法扩增了中华板胸蝗、日本鸣蝗、大胫刺蝗和青海痂蝗线粒体基因组序列,并对序列进行了测序、组装、注释、分析。联合本实验室已测的直翅目线粒体基因组序列和GenBank上收录的数据,共计94条序列,分别用最大似然法和贝叶斯法重建系统发育关系。同时,将94种蝗虫按照翅型的不同划分为长翅型和短翅型,使用PAML软件计算了两种翅型蝗虫线粒体蛋白编码基因的同义替换速率与非同义替换速率比值(co=dN/dS),用于研究在进化过程中两种翅型的蝗虫所受选择压力的情况。研究的主要结果如下：1.四个物种的全线粒体基因组序列长度分别为：中华板胸蝗15591bp,日本鸣蝗16046bp,大胫刺蝗16085bp,青海痂蝗15919bp；均由22个tRNA基因,13个蛋白编码基因,2个rRNA基因和一个A+T控制区组成,基因排列顺序和蝗总科的相同,均发生了KD转位现象,即tRNAASP(D)排在了tRNALys(K)之前。四个物种基因组序列的碱基组成有明显的AT偏向性,其中大胫刺蝗,日本呜蝗及青海痂蝗的AT含量均高于75%,中华板胸蝗是74%。2.除终止密码子外,线粒体蛋白编码基因的AT含量分别是：中华板胸蝗73%,日本鸣蝗75%,大胫刺蝗74.3%,青海痂蝗74.5%；四个物种蛋白编码基因密码子第3位点的AT含量最高,分别是：中华板胸蝗87.8%,日本鸣蝗90.1%,大胫刺蝗87.5%,青海痂蝗88.1%。蛋白编码基因的AT偏倚会影响密码子的使用情况,其中最常使用的起始密码子是ATN,终止密码子是TAN,其中中华板胸蝗,大胫刺蝗的ND5基因的终止密码子是TA,青海痂蝗CO1基因的终止密码子是T。3.除tRNASer(AGN)二级结构中的二氢尿嘧啶臂的缺失外,其余tRNA的均能折叠成典型的三叶草型二级结构。在tRNA的二级结构中存在一些碱基的错配现象,其中中华板胸蝗有31处错配,包括24个G-U,4个U-U,1个A-C, A-A, A-G错配,日本鸣蝗共有24处错配,包括21个G-U,1个A-A, A-G, U-U;大胫刺蝗错配存在23处,分别是21个G-U,1个A-A, U-U;青海痂蝗的错配有31处,其中有22个G-U,3个U-U,2个A-A,3个A-C,1个C-U。4.12S rRNA和16S rRNA基因均位于tRNALeu(CUN)和AT控制区之间,由tRNAVal基因分开。中华板胸蝗,日本鸣蝗,大胫刺蝗和青海痂蝗的12S rRNA的长度分别是788bp,847bp,834bp,836bp; 16S rRNA的长度分别是1315bp,1310bp,1316bp,1319bp。A-T控制区均介于12S rRNA与tRNAIle基因之间,四个物种中AT含量分别是：日本鸣蝗83.9%,大胫刺蝗84.5%,青海痂蝗84.7%,含量最高的是中华板胸蝗86.5%。5.本研究利用了最大似然法和贝叶斯法对94种直翅目昆虫不同的数据集进行了系统发生分析。结果如下：两种方法建树结果基本类似,并发现37genes和13PCGs数据集构建的系统树支持蝗亚目和螽亚目的单系性。在螽亚目中,驼螽总科和螽斯总科聚为一支,与蟋蟀总科互为姐妹群。在蝗亚目中,斑翅蝗科和斑腿蝗科分别形成单系群,大胫刺蝗和青海痂蝗具有很近的亲缘关系均聚在斑翅蝗科,与夏氏分类系统相同。在斑腿蝗科中,中华板胸蝗和中华稻蝗及小卵翅蝗的关系较近。蝗亚目中的蜢总科,蚱总科,蚤蝼总科以及蝗总科中的网翅蝗科,槌角蝗科及剑角蝗科均不支持单系性,例如剑角蝗科的日本鸣蝗和网翅蝗科的理塘白纹蝗总是聚在一起。6.按照翅型划分后,计算两种翅型的13个蛋白编码基因联合的ω值,发现长翅型和短翅型的ω不存在显著性差异。当对每种翅型的蛋白编码基因逐一进行选择压力的检验时发现,长翅型的ATP8基因的ω值大于1,表明此基因在进化过程中所受的适应性选择压力大一些；其他基因的ω值均小于1,表明这些基因所受净化选择压力强一些,用于维持它们的功能,保证能量供应的顺利进行。
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．２．２线粒体基因组生物信息学分析体系逡逑生物信息学分析是研究线粒体基因组学必不可少的生物学分析手段，大概包括４个步骤（图１－２）。首先是序列组装，在组装之前要对每条测序结果进ＬＡＳＴ同源性搜索Ｗ确定序列的可用性，删除测序质量差的和非目的序列后使装软件对可用的序列进行组装；其次是序列注释，，准确的基因组注释结果是组数据分析的先决条件，尤其对系统发育关系的重建，基因组重排机制的研及对序列变异作用的调查研究都有很重要的影响。目前有Ｈ个在线的全线粒因组注释程序，Ｄ０ＧＭＡ【５］邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｇｍａ．ｃｃｂｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／），逡逑ＯＳＡＳ【６］（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｓａｓ．ｂｙｕ．ｅｄｕ／），逡逑ＩＴＯＳ［７ｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｔｏｓ．ｂｉｏｉｎｆ．ｕｎｉ－Ｉｅｉｚｉｇ．ｄｅ／）可切利用，Ｈ者均能提供相应的图表格＾＾＞１及输出８６９扣１１格式的注释文件帮助新测序的线粒体基因组向0６１１６３１１杉库提交；第Ｈ步是注释完成的序列进巧结构基因组学的分析；最后联合其他体基因姐序列，使用软件确定ｍｔＤＮＡ序列进化的最适模型并推断出系统发育。逡逑

对ＤＮＡ稀释１０倍后用作Ｌｏｎｇ－ＰＣ艮的模板，所有Ｌｏｎｇ－ＰＣＲ所用引物见表逡逑２－３。扩增产物用化８％轻质糖凝胶电泳检测，对扩增较好的片段做切胶纯化后送公逡逑司测序。部分Ｌｏｎｇ－ＰＣ民扩增结果如图３－１。逡逑＇

本文编号：2547077