斜纹夜蛾性信息素合成激活肽（PBAN）的基因克隆及功能分析

发布时间：2019-11-02 09:35

【摘要】：斜纹夜蛾Spodoptera litura (Lepidoptera:Noctuidae)又名莲纹夜蛾,斜纹夜盗蛾,俗称花虫、黑头虫等,是分布于全世界的农作物主要害虫之一。斜纹夜蛾寄主范围广,食性杂,具暴食性,世代重叠且抗药性强,在适宜生境下很容易爆发成灾,严重时幼虫可将寄主叶片、花全部啃食,造成重大经济损失。利用性信息素诱捕和干扰交配已经在害虫的测报和防控中广泛应用,相应的昆虫合成与释放性信息素的内在机制也成为该领域研究的重点。蛾类昆虫性信息素合成主要由性信息素合成激活肽(PBAN)及其受体调控。PBAN由雌蛾咽下神经节合成并通过血淋巴到达性信息素腺(PG)并与其细胞膜上的受体结合,通过信号转导激活下游性信息素合成途径。PBAN由DH-PBAN基因编码,但该基因除了编码PBAN,还编码滞育激素及另外三种功能不明确的多肽(α-SGNP、β-SGNP、 γ-SGNP)。本研究通过简并引物和RACE扩增,首次获得了斜纹夜蛾PBAN基因的全长mRNA序列(GenBank ID:KJ205531),该mRNA序列全长809bp,含有一个编码191个氨基酸的ORF(573bp),其5’-UTR为34b、3'-UTR为199bp。通过神经肽切割位点(G-K/R-R和K-K)和FXPR/KL保守序列分析,发现这个含有191个氨基酸的前体蛋白在六个位点被切割并得到五个可能的神经肽：PBAN, DH以及α-、β-和γ-SGNP。通过SignalP4.0分析还发现该前体蛋白N端还含有一个17个氨基酸的信号肽。同源性分析表明斜纹夜蛾DH-PBAN的蛋白序列与其它鳞翅目(Lepidoptera)昆虫DH-PBAN同源性较高(60%),但与鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)及双翅目(Diptera)等昆虫的DH-PBAN同源性较低(40%)。基于斜纹夜蛾及其它11种昆虫的DH-PBAN ORFs所构建的系统发育树与昆虫分类学完全吻合,斜纹夜蛾和其它鳞翅目昆虫以98%的可信度构成了一个单系。实时荧光定量分析表明,PBAN基因在幼虫及蛹期表达量表现出一致性,均是随着龄期的增加表达量逐渐降低,到了老熟幼虫及老熟蛹期,PBAN几乎不表达,而在一龄蛹期表达量为一生最高。到了成虫期,PBAN的表达量受光周期及龄期影响较大,为白天大于黑夜,但无论白天还是黑夜,表达量都维持在一个比较稳定的水平。PG内4种性信息素[(Z9,E11-14:Ac)(A), cis-9, trans-l2-tetradecadienyl acetate (Z9,E12-14:Ac)(B), cis-9-tetradecenyl acetate (Z9-14:Ac)(C)和trans-11-tetradecenyl acetate (E11-14:Ac)(D)]含量的变化也与光周期及龄期有关,总体表现为黑夜大于白天,而刚羽化的雌虫性信息素含量最高。无论白天黑夜,羽化后3天内的成虫性信息素含量均维持在一定水平。通过注射人工合成的dsRNA进行RNA干扰并结合荧光定量分析,结果表明每只雌虫注射10μg的PBAN dsRNA(浓度为2μg/μl,即每只注射5μl)显著抑制了斜纹夜蛾PBAN基因的表达(相对表达量下调了60%左右),相应地RNA干扰后PG内4种性信息素的含量也显著下降。进一步地,通过给雌虫注射人工合成的PBAN,也显著地提高了雌蛾PG内4种性信息素的含量。交配对雌性斜纹夜蛾性信息素含量及PBAN表达量均有影响。雌蛾交配后,PBAN表达量降低,但性信息素含量反而升高。本研究首次克隆了斜纹夜蛾PBAN基因的全长mRNA序列,并进一步通过表达、RNAi、蛋白注射及性信息素合成量分析表明PBAN是斜纹夜蛾性信息素合成的关键调控分子。本研究为将来完全阐明斜纹夜蛾性信息素合成与释放的内在机制奠定了基础,并为基于性信息素及RNAi的害虫防治新途径的探索提供思路和靶基因。
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.4

【参考文献】