一株降解杀虫剂啶虫脒的细菌菌株分离鉴定及降解性能测试

发布时间：2020-02-03 22:46

【摘要】：桑园中残留的大量农药,有通过桑树富集最终对家蚕造成不良影响的潜在风险。采用富集培养和平板划线分离的方法,从长期被农药污染的桑园土壤中筛选分离到一株可降解对家蚕有极高风险性的杀虫剂啶虫脒的细菌菌株H2。对分离菌株H2进行形态和生理生化特征及16S r DNA序列分析,鉴定其为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。该菌株对啶虫脒的最高耐受浓度为1 200 mg/L;菌株在含300 mg/L啶虫脒的无机盐培养基中培养,0~1 d为生长延迟期,1~4 d为对数生长期,4~6 d为稳定期,6 d后进入衰亡期;菌株在啶虫脒初始质量浓度为300 mg/L的无机盐培养基中培养9 d,对啶虫脒的降解率为62.7%。同时发现H2菌株在分别含1 000 mg/L吡虫啉、1 000 mg/L烯啶虫胺、1 000 mg/L噻虫啉和500 mg/L辛硫磷的无机盐培养基中也能够生长,说明H2菌株能有效降解多种烟碱类农药和有机磷类农药,有望进一步开发为桑园残留烟碱类及有机磷类农药的微生物降解制剂。
【图文】：

形态图,菌株,菌落,菌体

450蚕业科学2017;43(3)图1菌株H2的菌落(A)与菌体(B)形态Fig.1Theclonies(A)andindividual(B)morphologicalcharacteristicsofbacterialstrainH2表2菌株H2的生理生化性状Table2Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofbacte-rialstrainH2项目Item结果Ｒesult氧化酶试验Oxidaseactivity+明胶液化试验Gelatinliquefactiontest－接触酶试验Catalaseactivity+淀粉水解试验Hydrolysisofstarch－麦芽糖发酵试验Maltosefermentationtest－葡萄糖发酵试验Glucosefermentationtest－硝酸盐还原试验Nitratereductiontest+甲基红试验Methylredtest－V-P测定试验V-Ptest－柠檬酸盐利用试验Citratetest+“+”表示可利用或为阳性反应，“－”表示不可利用或为阴性反应。“+”meansusableorpositivereaction，“－”meansnotusableornega-tivereaction.2.3菌株H2基于16SrDNA序列的分类鉴定啶虫脒高效降解菌株H2的16SrDNAPCＲ扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。测序鉴定PCＲ产物序列长度为1440bp。将该序列与GenBank数据库序列进行BLAST比对，并选取与其同源性高的典型菌株16SrDNA序列，通过MEGA5.0软件构建菌株的系统进化树，结果见图3。从进化树可以看出，菌株H2与产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)菌株Y34的遗传距离最近，聚在进化树的同一个分支上，序列相似度为99%。结合菌株H2的形态观察与生理生化性状测试结果，将其鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonasal-caligenes)，命名为PseudomonasalcaligenesH2菌株。2.4菌株H2的生长曲线将菌株H2接种于含300mg/L啶虫脒的无机盐液体培养基，测定其生长曲线，结果如图4所示。该菌株接种在此培养基中培养0～1d为生长延迟期，表明菌株对啶虫脒的适应时间较长;?

菌株,琼脂糖凝胶电泳,图谱,产物

alaseactivity+淀粉水解试验Hydrolysisofstarch－麦芽糖发酵试验Maltosefermentationtest－葡萄糖发酵试验Glucosefermentationtest－硝酸盐还原试验Nitratereductiontest+甲基红试验Methylredtest－V-P测定试验V-Ptest－柠檬酸盐利用试验Citratetest+“+”表示可利用或为阳性反应，“－”表示不可利用或为阴性反应。“+”meansusableorpositivereaction，“－”meansnotusableornega-tivereaction.2.3菌株H2基于16SrDNA序列的分类鉴定啶虫脒高效降解菌株H2的16SrDNAPCＲ扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。测序鉴定PCＲ产物序列长度为1440bp。将该序列与GenBank数据库序列进行BLAST比对，并选取与其同源性高的典型菌株16SrDNA序列，通过MEGA5.0软件构建菌株的系统进化树，结果见图3。从进化树可以看出，菌株H2与产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)菌株Y34的遗传距离最近，聚在进化树的同一个分支上，序列相似度为99%。结合菌株H2的形态观察与生理生化性状测试结果，将其鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonasal-caligenes)，命名为PseudomonasalcaligenesH2菌株。2.4菌株H2的生长曲线将菌株H2接种于含300mg/L啶虫脒的无机盐液体培养基，测定其生长曲线，结果如图4所示。该菌株接种在此培养基中培养0～1d为生长延迟期，表明菌株对啶虫脒的适应时间较长;接种培养1～4d为生长对数期，此时菌株快速生长;接种培养4～6d为稳定期，培养基D(600nm)值无明显变化;接种培养6d后，D(600nm)值开始下降，菌株H2进入衰亡期。2.5菌株H2对啶虫脒的降解能力配制质量浓度为300mg/L的啶虫脒标准样品，经高效液相色谱检测得到其保留时间为22.198min的单一峰，且峰型较好，基本无杂峰(图略)。同样条件下检测接入菌株H2后培养不?

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