microRNA簇miR-2～13～71通过Notch调控飞蝗的卵黄生成与卵母细胞成熟

发布时间：2020-03-21 16:29

【摘要】：飞蝗是不完全变态昆虫的代表,为世界性的农业害虫,整个发育阶段可分为卵期,若虫期和成虫期。飞蝗成虫具有很强的生殖能力,是蝗灾暴发的重要内因之一。飞蝗的生殖主要由保幼激素(Juvenile hormone,JH)调控,JH促进脂肪体中卵黄生成(Vitellogenesis),大量合成的卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)通过血淋巴运输到卵巢,进而被卵母细胞吸收,发育为成熟的卵。miRNA是一类广泛存在于真核生物中的小分子非编码RNA,通过抑制靶基因的翻译或降解靶基因的mRNA实现转录后水平上的调控。我们课题组的前期研究发现,在雌性飞蝗成虫中,miRNA的表达响应JH滴度变化,并且干扰Ago1能够阻断miRNA作用通路,进而抑制Vg合成、卵巢发育和卵母细胞成熟,表明miRNA在雌性飞蝗的生殖中发挥关键作用,但是miRNA具体的功能和调控机制并不明确。本论文研究综合利用转录组学、生物信息学和分子生物学的方法,阐述了miR-2簇(miR-2/miR-13a/miR-13b/miR-71或miR-2～13～71)在飞蝗卵黄生成和卵母细胞成熟中的功能,解析了miR-2～13～71通过靶基因Notch调节飞蝗生殖的分子机制。我们首先利用二代高通量测序技术,获得雌性飞蝗脂肪体miRNA的转录组信息。结合飞蝗基因组信息,对miRNA在基因组中的组织形式进行了分析,一共鉴定到25个成簇存在的miRNA。首先对覆盖范围在1500 nt之内的5个miRNA cluster进行分析,发现两个由保守miRNA组成的cluster。其中,位于scaffold29860的miR-2～13～71表达量在羽化后的正常发育中逐渐降低,进一步外源JH类似物(JHA)的处理结果显示,miR-2 cluster的表达被JHA抑制。通过体内注射miRNA的激动剂(AgomiR)过表达miR-2～13～71,导致飞蝗卵巢生长减缓,卵母细胞发育受阻。统计卵小管中首卵的长度,实验组中卵小管首卵长度显著变小,发育受到抑制。进一步的qRT-PCR分析发现,miR-2～13～71抑制飞蝗脂肪体中VgA和VgB的表达。这些研究结果表明,过表达miR-2～13～71抑制飞蝗Vg合成,进而延缓卵巢发育和卵母细胞成熟。利用miRanda软件,我们在飞蝗转录组水平上大规模预测了miR-2～13～71的靶基因。KEGG分析发现,Notch信号通路被显著富集。双萤光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀的结果表明,Notch为miR-2～13～71的靶基因,过表达miR-2～13～71显著抑制Notch的表达。同时,JH促进Notch的转录,干扰Notch能够抑制Vg的转录、卵巢发育和卵母细胞成熟,与过表达miR-2～13～71产生的表型一致。根据上述研究结果,我们提出了miR-2～13～71通过靶基因Notch调控飞蝗卵黄生成和卵母细胞成熟的作用模型,即JH通过上调Notch的表达,促进飞蝗的卵巢发育;虽然miR-2～13～71下调Notch的表达,但是JH可以抑制miR-2～13～71的表达进而维持Notch的正常水平,从而促进卵黄生成、卵巢发育和卵成熟。
【图文】：

合成模,群居型,散居型,飞蝗

图1-1 miRNA合成模式图(Lucas et al., 2015)。Figure 1-1 Model of miRNA biogenesis(Lucas et al., 2015)NA 在昆虫中的研究进展A 作为一类重要的调控生长发育的小分子，在昆虫激素调控的发育进作用。这在果蝇(Sempere et al., 2003)、家蚕(Liu et al., 2018)、烟草aran et al., 2010)、德国小蠊(Rubio et al., 2012a)、飞蝗(Wang et al., 201都得到证实。在飞蝗中，过表达 miR-133 抑制多巴胺合成途径中两个重 henna，使多巴胺合成减少，，致使蝗虫由群居型转变为散居型。抑制 ma 和 pale 的表达，导致群居型向散居型转变(Yang et al., 2014)。在果蝇中到 Wnt/Wingless（Wg）信号通路，miR-8 和 wntless 结合，抑制 Wg 的 -8 的表达，发现 miR-8 的缺失突变体对高温敏感，腹部色素沉积减少异常造成化蛹缺陷(Kennell et al., 2008; Kennell et al., 2012)。miR-305 的

飞蝗,基因组,家族,颈环

图 3-1 miRNA 簇在飞蝗基因组中的定位。iRNA 前体，蓝色为 miRNA 成熟体。右边的柱状图显示 5 个 miRNA 簇在正常发育飞肪体中的表达模式。0PAE 为羽化后 12h 内。n = 3.Fig 3-1 The orgnization of miRNA cluster in locust genome.步对 miR-2~13~71 的 RNA 二级结构进行分析（图 3-2A），发现 miR-2/ miR/ miR-71 有具有明显的颈环结构，具有 miRNA 的典型结构。且在这个 c 有 3 个拷贝，miR-13a, miR-13b 和 miR-71 分别有一个拷贝。对 miR-2 c体的序列进行比对发现（图 3-2B），其中 miR-2, miR-13a 和 miR-13b 的，并且拥有相同的种子区序列，表明它们可能属于同一个家族。进一步通据库比对，发现 miR-2，miR-13a 和 miR-13b 同属于 miR-2 家族。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.2

【相似文献】