苏云金芽胞杆菌Sip蛋白处理大猿叶甲后差异基因筛选和分析

发布时间：2020-03-23 01:13

【摘要】：十字花科蔬菜由于在长久以来都作为我国人民食用的主要蔬菜,受到了人们在生产生活方面的重视。大猿叶甲作为鞘翅目代表昆虫,是重要的危害十字花科作物的害虫。由于十字花科蔬菜的大面积种植,大猿叶甲对其造成严重危害并使其大量减产,造成巨大经济损失。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性杆状细菌,目前在农业害虫防控方面已经广泛应用Bt制剂,在对Bt资源的研究中发现,分泌蛋白Sip对鞘翅目昆虫(如大猿叶甲,CPB等)表现出极高的杀虫活性,对害虫的控制具有良好的应用前景。而目前研究发现,部分害虫对Bt制剂也表现除了抗性。所以目前研究者们开始关注昆虫的基因组信息,转录组信息等,以期筛选害虫应答毒素蛋白的靶标基因,从根本上对害虫进行防控。目前研究大猿叶甲基因进展缓慢,而且至今尚未有人公布大猿叶甲全基因组信息。大猿叶甲的完整转录组数据库在实验室的前期研究中已经取得,得到了SSR标签相关信息及其与Sip毒素蛋白互作过程中的信息,发现与解毒代谢相关的基因发生了差异性表达,其中常见的细胞色素P450,核糖体蛋白S8和L14以及肌肉蛋白LIM都发生了差异性表达。本研究分析了大猿叶甲在Sip毒素蛋白作用前后SSR标签的PCR扩增差异,发现被Sip毒素蛋白作用后,PCR扩增条带大小与Sip蛋白作用前并无差别,但是略呈弥散状。选择了P450,S8,L14和LIM这四个差异基因进行PCR扩增,并构建原核表达载体,分别表达高效约56 kDa,30 kDa,25 kDa和89 kDa的目的蛋白。分别扩增P450,S8,L14和LIM四个差异基因的核心片段,提取测序正确的正向插入片段和反向插入片段质粒,单酶切线性化后以此为模板合成双链RNA,测定RNA浓度并稀释至5.0μg/μL,注射至3龄/4龄末期大猿叶甲幼虫体内(约2μL),分别注射成功后1d,3d,5d和7d提取中肠进行RT-PCR检测,结果显示,注射一天后,S8,L14和LIM表达量均无明显变化,而P450的表达量则明显降低;到了第三天,S8,L14和P450基因表达量已相当微弱,表明干扰成功;而LIM基因到了第三天表达量仅有少许减弱,第五天相比第一天也稍有减弱,但与第三天差距不明显,直到第七天,基因表达量大幅度减弱,表明干扰成功。分别将未经处理的大猿叶甲和RNA干扰后的大猿叶甲饲喂Sip蛋白,结果发现,在饲喂蛋白12小时后,各组均未见死亡,24小时后,S8死亡率与对照组几乎无差别,P450死亡率相比于对照组略有下降,L14和LIM死亡率高于对照组;48小时后,L14死亡率略高于对照组,其他均有所下降,但差别不大;从第三天开始,四个干扰组死亡率已明显高于对照组,直到第七天全部死亡。此结果与RT-PCR检测结果大致相符。本研究结果对筛选大猿叶甲靶标基因,进一步防治大猿叶甲等鞘翅目昆虫提供了良好的材料,也可以对进一步筛选相应的Bt毒素蛋白受体提供新的思路,更为Sip蛋白日后的改造和实际应用提供初步的理论依据。
【图文】：

图 1-1 苏云金芽胞杆菌的芽胞和晶体[47]Figure 1-1 The spore and crystal in Bacillus thuringiensis[47]注：A-F：Bt 菌株的扫描电镜图；S：芽胞，C：晶体.4 Sip 蛋白Sip 毒素蛋白是 Bt 杀虫家族中的分泌型杀虫蛋白，对鞘翅目幼虫表现出明显毒性。在面研究上，Donovan 等人培养了他们随机挑选的一些 Bt 菌株，在这些菌株的上清液中发其能够杀死科罗拉多马铃薯甲虫（CPB）幼虫，这些研究人员选择了其中一个菌株进行研究，克隆出包含 1104 个碱基，编码 367 个氨基酸的新型 Bt 毒素蛋白，并将其命名p1A[48]。将 Sip1A 进行序列比对，发现其与 Mtx3 之间的相似性为 46％，并且 Sip1A 还起烟草蚜虫，棉铃虫幼虫和玉米根叶甲虫的萎缩和体重减轻[48, 49]。刘艳杰等人于 2012 年从 Bt 菌株 QZL26 中鉴定和克隆了 Sip 基因，但并未报道其杀虫[50]。Murawska 等人于 2013 年使用基因组测序技术显示 IS5056 质粒 pIS56-328 含有 Siy 等基因，但是他们仅描述了 cry1Aa3，cry1Ah21 和 cry1Ba1 的特征及杀虫活性，并未对因进行描述[51]。张金波等人在 2015 年克隆了来自 DQ89 Bt 菌株的长度为 1188bp 的 si并显示其对大猿叶甲有着较高的杀虫活性[52]。沙君雪于 2017 年在 Bt 菌株 QZL38 中鉴定隆出了长度为 1095，编码 365 个氨基酸的 sip 基因，其对大猿叶甲具有较高的杀虫活性

东北农业大学工程硕士学位论文种的遗传多样性[59-60]。沙君雪等对大猿叶甲全虫进行测序，利从头组装获得大猿叶甲完整转录谱。从多数据库中对比分析可以参考的大猿叶甲转录组和 SSR 分子标记的数据[61,62]。大实验室的前期研究中已经取得，用其构建大猿叶甲基因组文库00 对引物中筛选出了 22 对多态性 SSR 引物并进行 PCR 扩增后的研究提供了部分参考。的筛选金芽胞杆菌 Sip 蛋白处理大猿叶甲后差异基因，分别将 pET21白和 1μg·mL-1Sip 蛋白作用于大猿叶甲幼虫，分别提取 pET21b甲中肠，进行转录组测序。以阈值: |log2(FoldChange)| > 1 且 q对样品的测序结果进行差异表达分析，共获得 341 个差异表达2。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.11

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本文编号：2595923