苏云金芽胞杆菌cry2类基因表达研究

发布时间：2020-03-25 05:20

【摘要】：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)Cry2类蛋白对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性,并且与目前广泛应用于转基因作物中的Cry1类蛋白无交互抗性,是转基因抗虫作物重要的候选蛋白。目前,获得命名的cry2类基因共有94个,分为13类模式基因(cry2Aa-cry2Al,cry2Ba)。Cry2类蛋白具有序列相似性高,但是杀虫活性、杀虫谱及蛋白表达差异较大的特点。本研究重点围绕cry2类基因的表达特性开展研究,分析诱导温度、氨基酸序列差异、分子伴侣等因素对Cry2类蛋白表达的影响。具体包括本实验室克隆的五种模式的7个cry2类基因(cry2Aa9、cry2Aa17、cry2Ab4、cry2Ab29、cry2Ad2、cry2Ba2、cry2Ah1),分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和苏云金芽胞杆菌中进行了不同条件的表达,主要进展如下:1.分析了相同诱导条件下,不同cry2类基因在大肠杆菌中的表达情况。分别比较了20℃和30℃诱导下Cry2类蛋白表达量差异。其中Cry2Ah1蛋白的表达量均最高。通过比对Cry2Ah1蛋白与其它蛋白的氨基酸序列及三维结构差异,发现Cry2Ah1蛋白位于DomainⅡβ4与β5之间loop上的第355位缺失了1个氨基酸。对Cry2Ah1蛋白的增加氨基酸突变体Cry2Ahs(354位v变为s,355位添加p)、Cry2Ahv(355位添加p)进行相同条件诱导表达,这两种突变体的蛋白表达量显著低于Cry2Ah1蛋白,从而证实了Cry2类蛋白表达量与DomainⅡβ4与β5之间loop上的氨基酸数量密切相关。2.比较了在不同温度诱导下,在大肠杆菌中表达的7种Cry2类蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的杀虫活性,其中Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1四种蛋白对甜菜夜蛾有活性。在20℃诱导的条件下,蛋白浓度为100μg/mL时,Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白对甜菜夜蛾的体重抑制活性分别为42.74%、89.18%、87.02%、85.28%;在30℃诱导的条件下,蛋白浓度为100μg/mL时,Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ab4、Cry2Ah1蛋白对甜菜夜蛾的体重抑制活性分别为0、43.72%、47.48%、70.54%;结果表明Cry2类蛋白的活性受温度影响,且Cry2Ah1蛋白的活性受温度影响较小。3.对实验室先前构建的Cry2Aa蛋白Bt表达载体pHT315-cry2AΔo1进行了改造。通过定点突变的方法将ClaⅠ和NcoⅠ酶切位点引入cry2Aa基因两端,利用同源重组的方法构建9种cry2类基因的Bt重组表达载体;导入Bt HD73~-无晶体突变株后,9种蛋白均获得表达。比较了各重组菌对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、小菜蛾(Plutella xylostella)、东方粘虫(Mythimna separata)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物活性,除Cry2Aa9重组菌有活性外,其它重组菌均无明显活性。4.比较了Bt表达载体中分子伴侣ORF1、ORF2对Cry2类蛋白表达量及蛋白溶解性的影响。在分子伴侣ORF1、ORF2同时存在的情况下,Cry2类蛋白表达量显著高于ORF2单独存在,但是ORF1、ORF2同时存在对Cry2类蛋白在碱性溶液中的溶解性无显著影响。此进展为进一步改造Cry2类蛋白序列、提高蛋白表达及杀虫活性奠定了基础。
【图文】：

苏云金芽胞杆菌,芽胞,菌株,晶体

1.1.1 苏云金芽胞杆菌概述苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是革兰氏阳性细菌，属于蜡样芽胞杆菌族，与其它芽胞杆菌的主要区别是在芽胞形成过程中产生不同形状的伴胞晶体蛋白（图1.1）（Didelot, etal., 2009; Schnepf, et al., 1998）。Bt是一种广泛分布于自然界中的土壤、水域、植物落叶、苔藓及昆虫的尸体中的昆虫病原菌（Reyaz, et al., 2016; Zhang, et al., 2007），其杀虫活性主要与伴胞晶体有关，它是目前防治农业、林业以及公共卫生害虫的最成功的微生物杀虫剂（Deist, et al., 2014;Zhang, et al., 2016）。伴胞晶体是细菌生长至稳定期时产生的晶体状物质，又称杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins, ICPs）,包括Cry蛋白和Cyt蛋白（Schnepf, et al., 1998; vanFrankenhuyzen, 2009）。图1.1 苏云金芽胞杆菌SWK1菌株的芽胞和晶体Figure 1.1 Spores and crystals of Bt strain SWK1 (Reyaz, et al., 2016)1.1.2 苏云金芽胞杆菌的分类自 20 世纪初从家蚕（Bombyx mori）中分离得到第一株长杆状、有芽胞形成的菌株后，相继从世界各地分离得到一些形态特征相似、能形成伴胞晶体的芽胞杆菌，各种分类方法也随即产生（关雄，2006）。最初，研究者们根据 Bt 的形态特征和生化特性来鉴别不同亚种

命名规则,内毒素

蛋白蛋白的分类，H fte 等人根据内毒素氨基序列同源性以及杀虫活性的相似性将 Cry 蛋种类加罗马数字表示，对鳞翅目害虫有活性的为 CryⅠ类蛋白，对鳞翅目和划分为 CryⅡ类蛋白，对鞘翅目害虫有活性的属于 CryⅢ类蛋白，CryIV 是的蛋白（H fte, et al., 1989）。随着新基因不断被发掘，发现一些毒素杀虫差别很大；有的序列同源性很高、杀虫活性却大不相同。为了克服这一re 等人开发了一种新的分类方案。根据该方案，Bt -内毒素命名委员会仅划分。蛋白质名称主要由两部分组成，第一部分是蛋白质的种类及性质，不同等级，将毒素划分为四个等级（图 1.2），1、4 等级由阿拉伯数字表写英文字母和小写英文字母表示，四个等级划分是分别以序列相似性 45%rickmore, et al., 1998）。截至 2019 年 3 月，812 个 cry 基因被国际命名委员8 个基因家族。（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.1

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