禾谷镰刀菌细胞自噬途径相关基因的功能分析
发布时间：2020-03-26 03:46
【摘要】：细胞自噬途径是真核生物高度保守的一类亚细胞降解途径,通过自噬体的形成降解大分子蛋白质和细胞器,维持细胞内生理平衡和帮助细胞度过逆境。到目前为止,在酿酒酵母中已经有38个细胞自噬相关基因被发现,并且大多数Atg蛋白的生物学特性也得到了研究阐述。但在禾谷镰刀菌中,仅FgATG8和FgATG15被研究报道,其余ATG基因的生物学特性和功能均未见研究报道。本文通过同源比对共鉴定到28个自噬相关基因ATGs,并初步阐明了这些基因在禾谷镰刀菌的营养生长、无性和有性生殖以及对小麦致病性和毒力中的作用,并以FgATG1、FgATG5和FgATG20为重点研究了其在禾谷镰刀菌细胞自噬途径中的生物学功能,主要研究结果如下:1.通过同源比对,在禾谷镰刀菌基因组中共鉴定了 28个ATG基因,并通过同源重组双交换的方法获得了这28个ATG基因的敲除突变体。根据在PDA平板上的生长速率与野生型菌株PH-1有无明显差异,将这些突变体分为了两组,组一的生长速率与野生型菌株PH-1相比有明显差异,生长减慢;组二则与PH-1无明显差异。同时,大部分突变体气生菌丝相比于PH-1明显减少,表明多数细胞自噬相关基因可以影响禾谷镰刀菌的生长速率及气生菌丝的生长。此外,发现多数突变体产孢量明显下降,致病力明显减弱(除△Fgata17之外),DON毒素产生量明显下降。这些结果表明细胞自噬对禾谷镰刀菌营养生长、产孢、致病性和DON毒素产生是必需的。2.对禾谷镰刀菌FgATG1和FgATG5的生物学功能作了进一步的研究。FgATG1和FgATG5可分别恢复稻瘟病菌△Moatg1和△Moatg5突变体在营养生长、产孢和致病方面的缺陷。禾谷镰刀菌突变体△Fgatg1和△Fgatg5不能产生子囊壳和子囊,在N饥饿诱导条件下不能产生自噬小体,且激光共聚焦显示GFP-FgAtg8蛋白的液泡转运受阻,Western blot实验发现FgAtg8随自噬体的降解过程受抑制。点突变分析发现,K53、D213和T228位点突变为丙氨酸时,菌落形态与敲除突变体△Fgatg1一致。上述结果表明,FgATG1和FgATG5在分子生物学功能上相对保守,两者对禾谷镰刀菌的有性生殖十分重要,同时参与其细胞自噬过程中自噬小体的形成,且对FgAtg8正常的转运和降解是必要的,此外,K53、D213和T228位点是FgAtg1蛋白的三个关键氨基酸位点。3.在28个ATG基因的敲除突变体中,△Fgatg20和△Fgatg24突变体的菌落形态非常相似,但不同于其余突变体,且结构域分析发现FgAtg20与FgAtg24蛋白含有相同结构域,因此,本文选取△Fgatg20为代表,重点研究了FgATG20基因的生物学特性与功能,取得以下结果:(1)突变体△Fgatg20生长速率明显减慢,气生菌丝稀少,几乎不产生分生孢子,但能够正常产生子囊壳、子囊和子囊孢子,致病力减弱。(2)缺失FgAtg20蛋白的PX结构域后,生长表型和致病力与突变体△Fgag20类似。(3)FgAtg20-RFP蛋白的亚细胞定位呈现细胞质中的点状分布,且FgAtg20-RFP与GFP-FgAtg8共定位。(4)透射电镜发现在N饥饿诱导条件下突变体△F△Fgatg20的菌丝细胞的液泡中无自噬小体产生。(5)发现突变体△Fgatg20中FgApell-RFP弥散于细胞质中,而PH-1中FgApel-RFP在细胞质中呈点状分布,同时突变体中FgApel前体的成熟被抑制。(6)Western blot实验证实突变体△Fgatg20中线粒体自噬标记蛋白Porin的降解与PH-1无差异,且共聚焦显微镜结果显示在PH-1和△Fgatg20中MitoFluor-Red染色后的线粒体均能够与CMAC标记后的液泡融合。(7)经Western blot实验证实,突变体△Fgatg20中过氧化物酶体自噬标记蛋白Pex14的降解被抑制。(8)酵母双杂交实验表明FgAtg24,FgAtg17和FgAtgll 均与 FgAtg20互作,FgAtgl 与FgAtg17互作,且也与FgAtg24互作,但不与FgAtg20直接互作,也不与FgAtgll互作。综合上述结果表明,FgATG20参与禾谷镰刀菌的营养生长、无性生殖和致病过程,PX结构域对FgAtg20蛋白功能十分重要。FgATG20对自噬小体的形成是必需的,该基因参与禾谷镰刀菌中的非选择性宏自噬过程和过氧化物酶体自噬过程,但不影响线粒体自噬过程。FgAtg20蛋白与FgAtgl,FgAtgll,FgAtg17和FgAtg24形成一个多聚体,共同参与禾谷镰刀菌中的细胞自噬过程。本研究结果表明,细胞自噬参与禾谷镰刀菌的营养生长、生殖和致病过程,自噬蛋白之间相互作用共同参与调控禾谷镰刀菌中的细胞自噬过程。此外,在禾谷镰刀菌中除了细胞自噬途径受TOR信号通路调控之外,FgHLTF1也受到TOR信号通路调控,是TOR信号通路下游的一个转录因子,对其进行分子生物学功能分析研究发现,FgHltfl定位于细胞核中,同时FgHLTF1基因缺失后,相应的突变体生长明显减慢,色素明显减少,不能产生子囊壳,不能正常侵染麦穗;但是突变体产生DON毒素的量相比于野生型没有下降,且产生分生孢子的数量与野生型相比没有明显差异;突变体在添加了 1M Sorbitol、KC1和NaC1的CM平板上生长明显受到抑制,同时0.7MNaCl处理2小时后,FgHog1不能响应渗透胁迫从而进入到细胞核中。这些结果表明FgHLTF1基因在禾谷镰刀菌的营养生长、有性生殖和致病性中起重要作用,同时参与了 HOG信号通路,但不参与DON毒素产生和无性生殖过程。
【图文】：
图１．丨禾谷镰刀菌
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本文编号：2600905
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