荧光修饰双链DNA偶联单链DNA的三螺旋分子信标检测转Bt基因

发布时间：2020-03-31 14:17

【摘要】：当今世界,科技发展日新月异,科技的进步带动现代生物技术的大发展,其中转基因技术又被称之为人类历史上具有飞跃性进步的第二次“绿色革命”。转基因技术就是在作物原有基因的基础上引入外源基因,改造其遗传物质,使其营养价值、生物性状更好的满足人类的需要。利用转基因技术把苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)转入到小麦体内,目的主要是增加小麦的抗虫性,其中苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素基因是小麦获得抗虫性能的最主要原因。但是转基因技术也存在一定的生物安全性问题,所以世界各国不断加强对转基因作物的监管力度与检测手段的研发。本论文应用标记荧光猝灭基团(BHQ-1)的单链DNA(triplex-forming oligonucleotides TFO)和两端同时标记荧光基团(FAM-6)的单链DNA(Single DNA S-DNA)构建三螺旋DNA分子信标,然后目标DNA单链(Target DNA T-DNA)和三螺旋DNA分子信标接触,导致三螺旋结构发生改变,从而引起荧光信号强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测。主要内容如下所示:弱酸性环境下自组装三螺旋分子信标用于转基因作物中的目标基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)灵敏检测;最近几年,三螺旋分子信标被广泛用于转基因作物的灵敏检测,其中包括T·A?T和C~+·G?C(?是Watson-Crick氢键,·是Hoogsteen氢键)等三螺旋结构在内的分子信标是最为常用的。当三螺旋分子信标形成时,含有嘧啶链(胸腺嘧啶T和胞嘧啶C的)的单链DNA(triplex-forming oligonucleotides,TFO)需要在弱酸性环境下首先质子化后才能和双链DNA的嘌呤链(A和G)结合形成稳定的三螺旋分子信标,其中含有胞嘧啶C的DNA单链(TFO)质子化后,带正电的胞嘧啶C~+与带负电的DNA双链由于静电作用,能够起到稳定三螺旋分子信标的作用。目标DNA单链加入后可以破坏三螺旋信标的结构,导致荧光强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测,检测下限达到1 pM。中性环境下自组装三螺旋分子信标用于转基因作物目标基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)灵敏检测;为了扩展三螺旋分子信标的应用范围,在本论文中人为加入Ag~+用来增加三螺旋分子信标在中性环境下的稳定性。Ag~+不仅能够特异性识别C·G?C的三螺旋结构,而且还可以把C~+·G?C中的H~+置换成Ag~+C·G?C新的三螺旋结构,这样Ag~+的加入就极大的增加三螺旋分子信标的应用范围。目标DNA单链加入后可以破坏三螺旋信标的结构,导致荧光强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测,检测下限达到0.1 pM。
【图文】：

1100 万 hm2(王宇，2014)。自转基因技术发展到今天，美国是世界上最早技术，也是商品化种植最多的国家。截止到 2015 年时，美国约 94%的棉花豆、92%的玉米均是转基因作物。转基因作物的种植也为美国农业带来了巨2017 年，我国的转基因植物种植面积为达到 370 万 hm2，主要是以木瓜、为主，但小麦、玉米、水稻、大豆等主要粮食作物未种植转基因品种(Zhan)。从 20 世纪 80 年代中期的“十五”开始，我国就重点开展功能基因克隆心技术创新、新产品培育与产业化、转基因新材料创新和转基因作物安全性的研究(汪其怀，2017)，充分利用我国现有的资源和人才追赶世界发展脚步大突破和科技创新成果。目前，我国虽然实现主粮的基本自给，但农产品缺口的大多数粮食作物均为转基因作物，我国逐步成为转基因粮食产品的消涛，2017)。

云金芽孢杆菌最早是 Ishiwata 在蚕蛾中发现的，后来又因在德国苏云金省重命名。直到二十世纪五十年代人们才发现苏云金芽孢杆菌的杀虫活性是由该变成孢芽时产生的晶体蛋白造成的，因为这些晶体蛋白具有一定的杀虫效果为杀虫蛋白或者是苏云金杆毒蛋白。苏云金芽孢杆菌转基因草地植株对多种抗性，而且食用该植株的棉铃虫幼虫的死亡率高达 80%。转苏云金杆毒蛋白列 Cry1A 基因的棉花，不仅对鳞翅目类害虫有高抗性，而且还同时对双翅目具有抗性(Toshiyuki et al，，2011)。我国在 1991 年就研制出了转 Bt 基因的甘蓝花等，其中我国第一代转 Bt 基因的抗虫棉花的抗虫性达到了 95%以上%-80%的农药用量，产量增加了 40%-50%。到现在为止，全球共有 60 多种转植物，其中大多数应用的苏云金杆毒蛋白氨基酸序列是 Cry1，也有少部分是在我国研制成功的转 Bt 基因植物主要有马铃薯、水稻、番茄、玉米、大豆麦等。其中玉米和棉花已经进入大规模商业化推广阶段(张宝红，2000）。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;S188

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本文编号：2609185