辣椒疫霉效应分子RxLR98344蛋白结构解析和PcUE1酶活性研究

发布时间：2020-03-31 21:09

【摘要】：辣椒疫霉Phytophthora capsici是一种土壤传播的植物病原体,具有多种宿主。病原体在宿主植物感染过程中分泌大量效应物,包括CRN、RxLR效应物,但其在病原菌中的作用机理仍然大部分未知。为此,本研究对辣椒疫霉RxLR效应因子及脱氢酶进行研究。辣椒疫霉侵染的作物主要包括辣椒、茄子、西红柿、黄瓜等茄科作物,在全国各地都有发生的报道。疫霉病发病迅速,发病范围大而广,对蔬菜的产量和品质造成极大的损失和影响。目前辣椒疫霉卵菌的主要防治手段是化学防治以及抗病品种种植,由于化学防治方面药剂单一,病原菌抗药性增强,因此,卵菌蛋白结构生物学为筛选新的药物靶点、设计低毒高效的杀菌药物提供了理论依据。我们通过解析辣椒疫霉RxLR效应蛋白的结构进行致病机制及功能的研究,利用基因克隆,将目的基因RxLR98344构建到pET28a载体上;采用最常用且效率高的原核表达系统,大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主,IPTG诱导目的蛋白表达;通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析等技术进行蛋白纯化;运用气相扩散法坐滴法和悬滴法两种方法筛选目的蛋白晶体;最后通过X-ray衍射进行数据的收集,并将得到的高质量数据进行目的蛋白三维结构的解析。硫胺素焦磷酸(ThDP)在植物或动物体内常作为一种辅酶,帮助其受体蛋白催化和转运底物,在生命体生长代谢过程中起着不可或缺的作用。PcUE1是在辣椒疫霉卵菌中首个发现的ThDP-依赖型酶。目前,我们已经拿到了PcUE1的三级结构,其结构特征表明PcUE1与其它菌体中的NAD~+依赖型醇脱氢酶具有较高的相似性。经进一步分析发现PcUE1的三级结构催化中心构象与ThDP-依赖型酶的不同,此外PcUE1三级结构中没有看到NAD~+辅因子的结合。根据其三维结构构象及特点,我们推测了18种可能底物,并利用动力学紫外分光光度计及高效液相色谱进行酶活测定分析。主要研究结果如下:(1)从辣椒疫霉基因组SD33中克隆了RxLR98344的目的基因,RxLR98344效应分子的N端包括RxLR-DEER保守区,C端为效应区,符合RxLR效应分子的序列特征。将RxLR98344克隆构建到带有His标签的pET28a原核表达载体上,在大肠杆菌内诱导进行大量表达;(2)RxLR98344蛋白经镍柱亲和层析、阳离子交换层析和分子筛层析后,得到了较高纯度且较均一的母体蛋白溶液和硒代蛋白溶液;通过气相扩散坐滴法和悬滴法,采用Hampton结晶试剂盒进行蛋白晶体结晶条件的筛选,通过X-ray衍射得到分辨率为2.6?的RxLR98344母体蛋白数据;硒代蛋白晶体正在进行进一步收集硒代数据。(3)RxLR98344不能引起本氏烟(Nicotiana benthamiana)的细胞死亡,不能够引起HR反应。RxLR98344分别与INF1、Bax、CRN4共表达结果表明,RxLR98344能够抑制Bax,不能抑制INF1、CRN4引起的细胞坏死。(4)通过解析PcUE1突变体三维结构以及质谱分析发现其结合NAD~+辅因子。此外,根据其结构构象特点,我们预测了18种底物,并通过动力学紫外分光光度计及高效液相色谱进行了酶活测定分析。发现PcUE1可能作为NADH依赖型脱氢酶,参与氧化还原的可逆反应,并初步测定其还原底物为间硝基苯乙酮、对硝基苯乙酮。
【图文】：

模式图,字形,模式图,病原物

44 蛋白结构解析及功能分析和 ThDP-依赖型酶活性研究4图1 植物的防卫系统“Z”字形模式图 (Jones et al., 2006)Fig. 1 A zigzag model illustrates the quantitative output of the plant immune system.(Jones et al., 2006)目前的研究认为病原物与植物的互作可以概括为一个“Z”形的模式（图1）。首先是植物细胞膜上的受体PRRs识别出病原MAMPs/PAMPs ，使基础防卫反应得以激发，防止病原物的侵入，即病原相关分子模式激发的免疫反应PAMP-Triggered Immunity (PTI)。而病原物进化泌出克服植物的防御机制的效应蛋白，定位到植物细胞质中破坏寄主的PTI反应，使寄主感病。对于这种由效应因子引起的免疫反应，我们称为触发免疫Effector-Triggered Immunity(ETI)。ETI能够使植物产生抗病反应，，称为过敏性坏死反应（hypersensitive cell death response, HR）。1.3 卵菌 RxLR 效应因子的研究进展在植物与病原菌长期的相互竞争中，植物已经进化出了能够识别效应物的抗性（R）蛋白，以抵御病原菌的侵染。植物的抗病过程是多种多样的（Hiller et al.

卵菌,效应,蛋白,效应因子

性细胞死亡。因此分泌效应蛋白的主要功能是抑制介导植物防御反应的细胞信号转导途径（Win et al.，2007; Bhattacharjee et al.，2006; Nunes et al.，2007）。图2 卵菌 RxLR 效应蛋白作用模式图（Sanju and Thakur, 2014）Fig. 2 Action map of oomycete RxLR effectors ( Sanju and Thakur, 2014)RxLR 和 CRN 效应物的功能分析（图 2）。RxLR 区域在分泌和靶向中起作用并且C 端区域携带效应活性并在植物细胞内进行操作。CRN 是具有由 C-末端区域编码的效应物活性的模块化蛋白质。1.3.2 RxLR 效应因子的种类迄今为止报道了六种卵菌无毒效应物：来自大豆病原体大豆疫霉菌（Phytophthorasojae）的 Avr1b; ATR1 和 ATR13 拟南芥病原菌透明粘虫;和 Avr3a，Avr4 和 Avr1b 来自马铃薯和番茄病原体致病疫霉。所有上述六种蛋白质都具有 RXLR 基序，该基序自那以来就被证明是效应子 Avr3a 和 Avr1b 穿过植物宿主细胞质膜所必需的（Boutemy et al.,2011; Yaeno et al., 2011; Maqbool et al., 2016; Chou et al., 2011; Sun et al., 2012; Leonelliet al., 2011）。来自致病疫霉的 RxLR 效应分子 Avr3a 最初是无毒效应因子，由马铃薯中相应的抗性蛋白质 R3a 识别。Avr3aKI但不是 Avr3aEM激活马铃薯抗性蛋白 R3a 以触发效应子触发免疫（ETI）。另外，这两种形式都能够抑制由致病疫霉素诱导素感染素1（INF1）诱导的宿主细胞死亡，在没有 R3a 的情况下。Avr3aKI表现出更强的抑制作用，而 Avr3aEM抑制作用相对较弱（Sohn et al., 2007; Bos et al., 2006; Dou et al., 2008b）。除了 RxLR 效应因子之外，卵菌还分泌另一类称为'Crinkler's（CRN's）蛋白质的细胞质效
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.44

【参考文献】